Name: direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Dette arbeidet har vært støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 og Friedrich-Baur-Stiftung. Vi ønsker å takke Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories ved University of California, San Diego for å gi oss Tag-RFP-T2. Vi heldigvis erkjenner David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, og Didier Trono, Universitetet i Genève, Genève, for å gi oss den lentiviral plasmider FUGW, og psPAX2/pMD2.G.

Denne protokollen introduserer TED brukes på cellelinjer, hippocampus nevroner og kortikale gliaceller. TED ytelsen er best når TED vektorer er stabilt uttrykt, for eksempel ved lentiviral vektorer. En skjematisk oversikt over TED-metoden er vist i figur 4.. En. Utarbeidelse av løsninger Følgende løsninger bør være forberedt før du starter og kan lagres som angitt. Vi bruker vanligvis steriliserte glass og plastmateriale og autoklavert vann...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signaling+in+neurons.">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li><li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+ER+calcium+dynamics.">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li><li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons.">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li><li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Ca2++from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1,4,5-trisphosphate.">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li><li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction.">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+as+cellular+sensors.">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li><li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIMulating+store-operated+Ca(2+)+entry.">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li><li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins.">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li><li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li><li>Sch&#228;uble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca(2+)+leakage+from+the+ER.">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li><li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events.">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li><li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane.">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li><li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses.">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li><li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).</li><li>Lang, S., Sch&#228;uble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca(2)(+)+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms.">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).</li><li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+forward+to+seeing+calcium.">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li><li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators.">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2++concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells.">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li><li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2++oscillations.">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1,4,5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2.">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li><li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum:+an+overview+of+modern+approaches.">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li><li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons:+direct+visualization+of+Ca(2+)-induced+Ca(2+)+release+triggered+by+physiological+Ca(2+)+entry.">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li><li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, (2010).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li><li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes.">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li><li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity.">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li><li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading.">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , (2012).</li></ol>

Fordelene og ulempene ved TED metoden har vært diskutert mye i nyere publikasjoner 34,35. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor, omgår TED problemet med å forstyrre og perfusing cellene. Videre to aspekter må vektlegges. Prinsippet for TED for ER kalsium avbildning krever (1). Den målrettede ekspresjon av et aktivt karboksylesterase i ER lumen ved hjelp av TED vektor konstruksjoner og (2). Den effektive og preferensiell frigjøring av lav-affinitet syntetiske AM-esterne kalsium ...

For å løse fysiologiske kalsium reaksjoner fra ER, har vi utviklet en ny strategi for å forbedre fangst av syntetiske kalsium sensitive fargestoffer inn i ER. Metoden gjør det mulig direkte, ikke-forstyrrende sanntids overvåking av fri ER kalsium i nærvær av ekstracellulært kalsium. Funksjon og signalering av Akutten Kalsium Kalsium signaler finnes i forskjellige celletyper, for eksempel muskel-celler, nevroner og gliaceller og deres funksjoner spenner fra formidling muskelkontraksjon til et engasjement i synaptiske transmisjon i læring og hukommelse 1,2. Endringer i fritt kalsium konsentrasjonen er av høy vitenskapelig interesse fordi kalsium er involvert i reguleringen av gentranskripsjon, celleproliferasjon, neuronal oppstemthet, celledød og andre cellesignalisering hendelser 1-7. Alle disse cellulære kalsium signalene er funksjonelt koblet til og bidra til intracellulær kalsiumbutikken dynamikk 8-10. Et felles trekk blant alle kalsium-signaler er flyten av kalsium mellom det ekstracellulære rom, cytosol og organeller, hovedsakelig ER og mitokondrier. Dette fører til dynamiske endringer i kalsium-konsentrasjon innenfor disse organeller, som er avfølt av forskjellige signalveier komponenter. Generelt, kalsium konsentrasjon på akuttmottaket varierer mellom 100-800 mikrometer, i cytosol kalsium konsentrasjonen er nær 100 nM, og i det ekstracellulære rom konsentrasjonen er rundt 1-2 mm. Følgelig er det en høy kjemisk drivkraft for kalsium flyter mot cytosol 2,9,10. De mest vanlig undersøkte ER-avledet kalsium signaler avhenger av stimuleringen av G-proteinkoblede reseptorer (GPCR), som deretter aktiverer fosfolipase C (PLC). PLC i sin tur produserer inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1. Ved binding av IP 3 til rec sineptor (IP 3-Rec, en figur) i ER-membranen, er kalsium ioner frigjøres fra ER lumen. Historisk sett var IP 3-mediert kalsium utgivelse fra ER først - selv om indirekte - målt i acinøse bukspyttkjertelen celler ved Streb et al i 1983 11.. Denne publikasjonen foreslått for første gang et signal kaskade involverer acetylkolin, fosfolipase C, og IP 3. Denne måten av kalsium utgivelsen er vanligvis betegnes IP 3-indusert kalsium utgivelse (IiCR) (Figur 1). Kinase-avhengig aktivering av fosfolipase Cγ av reseptor tyrosin kinaser lenker virkningen av vekstfaktorer og neurotrophic faktorer til ER kalsium signalisering etter IP 3 høyde 12. I tillegg til IiCR, kan kalsium høyde være mediert ved ionotrope kalsiuminngangen, for eksempel via spenningsstyrte kalsiumkanaler Ca (V), og påfølgende kalsium-indusert kalsium-slipp (CICR) ved re ryanodineceptors (RyR). IiCR og CICR er fysiologisk knyttet til butikk-opererte kalsium oppføring (SOCE). SOCE inkluderer virkningen av STIM (stroma samspill molekylet), som er en sensor for ER kalsium utgivelse. Stim har vist seg å stimulere ekstracellulær kalsium posten gjennom transient receptor mulige kanaler (Trp), 13 Orai kalsiumkanaler 14 og til og med spenningsstyrte kalsiumkanaler 15 (figur 1). Tap av ER kalsium er dynamisk reddet av handlingen av Sarco-endoplasmic retikulum kalsium ATPase (SERCA), som aktivt pumper kalsium tilbake i ER. Blokkerer SERCA med rusmidler som thapsigargin avduker en kontinuerlig tap av ER kalsium til cytosolic kupé. Dette ER kalsium &quot;lekkasjen&quot; er forårsaket av ER intramembrane pore komplekser slik som Sec61 proteinkompleks 16,17 (figur 1). I 1998 publiserte Berridge en modell, &quot;nervecellen innenfor et nevron modell&quot;, hh antyder et prinsipp fysiologisk rolle ER i å integrere neuronal kalsium fem. Denne modellen betrakter eksistensen av en kontinuerlig ER membransystem danner en intracellulær &quot;bilde&quot; av den neuronale plasmamembranen 5.. Dette binære eukaryote membran system ble hevdet å være en grunnleggende forutsetning for temporal og romlig integrasjon av raske og langsomme kalsium signaler i nerveceller. Kalsium signaler som oppstår enten samtidig eller senere i forskjellige pigger eller dendritter av samme nervecellen er overdratt til cellens soma eller kjernen via akuttmottaket, hvor de blir summert opp 5,18. Deretter kan deres sum ha effekter på excitability av nervecellen, regulering av gentranskripsjon eller integrering av signalering kaskader. Således støtter ER integrering av kalsium-signaler. En forutsetning for dette konseptet er at kontinuiteten av ER i en enkelt celle, som er blitt krevd av flere studier, og som har vist seg i det minste for somato-dendritic områder og kort avstand aksonale anslag 19-21. Enten det er ER kontinuitet i lange aksonale anslag er et spørsmål om debatt. Strategier for å måle strømmen av fritt kalsium over ER membranen Kalsium signaler er oftest overvåket i cytosol 22,23. Derfor kan det ikke lett kan identifiseres enten Ca 2 + strømmer inn i cytosol fra ekstracellulære eller intracellulære fra butikker 6,24. For å overkomme denne begrensningen, har metodiske strategier for direkte ER kalsium bildebehandling blitt utviklet. Oppsummert er følgende strategier brukt: (1) ER-målrettet genmodifisert protein-indikatorer 25-27 Protein-baserte lav affinitet Ca 2 + indikatorer bruke selvlysende protein aequorin eller GFP i kombinasjon med en kalsium sensing protein.. Disse genmanipulerte Ca 2 + indikatorer (GECIs) kanvære rettet til ER ved hjelp av en signal peptid og er aktivt holdt i ER ved hjelp av en retensjon og gjenfinning motiv. Felles ER Ca 2 + indikatorer base på Cameleon prinsippet og er Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon split YC7.3ER 29, og Cameleon D1 30. (2) Direkte esterase-basert dye lasting av AM-ester lav affinitet Ca 2 + indikatorer 31,32. AM-derivater av indikatoren fargestoffer (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passere biologiske membraner i en lipofile, kalsium-ufølsom tilstand. Deretter, i cytosol, så vel som i ER, endogene esteraser spalter av AM-estergruppen og slipper Ca 2 + indikator, etterlater en viss mengde aktivt fargestoff i cytosol og i ER. Derfor er denne tilnærmingen nyttig under betingelser med en høy kalsiumkonsentrasjon i ER så lenge cytosolisk kalsium-konsentrasjonen forblir godt under debeskyttelse grensen for lav affinitet indikatorer, særlig i karakteristiske kalsium signaler (f.eks nM til lave mikrometer). (3) AM-ester lasting i kombinasjon med plasmamembranen permeabilization 32.. Enhver gjenværende cytosoliske Ca 2 + Indikatoren fjernes ved plasmamembranen permeabilization med små mengder av en &quot;mild&quot; vaskemiddel (f.eks saponin) i en kunstig intracellulær buffer. Således kan de intracellulære membraner bli stimulert, for eksempel med IP 3 i den intracellulære buffer, direkte gjennom &quot;porer&quot; i plasmamembranen. (4) Dialyse av cytosol &#39;under hel-celle-konfigurasjon og samtidige målinger av Ca 2 + i ER lumen og cytosol 32,33. En celle først lastes med en lav-affinitets Ca 2 +-indikator (f.eks Mag-Fura2- AM, proporsjonal, UV-lys). Etterpå, med hjelp av en patch pipette, eventuelle gjenværende cytosolic lav-affinitets Ca 2 + indikator dialyseres ut av cytosol med en buffer som inneholder et høy-affinitets Ca 2 +-indikator (f.eks Fluo-3, synlig lys). Denne strategien gjør det samtidig opptak av cytosolic og ER avledet signaler. (5) Målrettet-esterase-indusert dye lasting 8,34. En karboksylesterase (CES) er rettet til lumen av ER og gir en høy esterase aktivitet for effektiv fangst av AM-ester form av lav-affinitet Ca 2 + indikatorer. Målrettet-esterase indusert dye lasting (TED) For å bedre målretting av lav affinitet Ca 2 + indikatorer til ER lumen, ble TED utviklet. TED krever overuttrykte en ER målrettet mus karboksylesterase (CES2) (figur 2), som oppnås via ekspresjonskonstruksjoner. Celler som uttrykker et rekombinant CES-konstruktet blir inkubert med AM-esterform av et kalsium idikator fargestoff (Fluo5N-AM, figur 2). Deretter, i ER, er fargestoffet omdannet til Ca2 + sensitiv, ugjennomtrengelig membran Ca 2 + indikator kompleks (Fluo5N/Ca 2 +) med høy esterase aktivitet, derfor overlapping fargestoffet i en høy konsentrasjon i ER lumen 8 , 34. Metoden er spesielt nyttig å undersøke ER kalsium-release via IiCR-trasé for eksempel via metabotrope, purinergiske-eller glutamat reseptorer 8,34 og visualisere ER kalsium uttømming via &quot;lekkasje kanaler&quot; direkte, for eksempel etter blokade av SERCA 17 , 34. Til vår erfaring med lav affinitet Ca 2 + indikator Fluo5N-AM er i dag den beste tilgjengelige indikatoren for å bruke med TED fargestoff lasting strategi. Fluo5N-AM har lav affinitet for Ca 2 + (dissosiasjonskonstant K D ~ 90 mikrometer, figur 2), er nesten ikke-fluoriserende i sin AM-form, men gir høy fluorescensemisjon på Calcium binding 8,34. Den Fluo5N/Ca 2 + kompleks kan bli eksitert med en standard-lyskilde på ~ 490 nm, som tilsvarer vanlige fargestoffer slik som FITC, 488 Alexa, eller eGFP. Cytosolisk kalsium signaler neppe oppnå en konsentrasjon i det lave uM området og blir derfor knapt påvises ved Fluo5N i cytosol 35.. For å forbedre TED ytelse, ble flere rekombinante vektor konstruksjoner utviklet (figur 3). Opprinnelig er TED vektorer basert på koding sekvensen av CES2 (Refseq tiltredelse nummer NM_145603, CES2c) og beste TED ytelse observert med stabil uttrykk for CES konstruksjoner. Nye TED vektorer uttrykke et kjerneelement i CES2 smeltet til rød fluorescens protein TagRFP-T2 36. Disse vektorene har den fordelen at de kan brukes til å identifisere transduserte celler og å bruke den røde fluorescens som en intern kontroll for normalisering av endringer i Fluo5N/Ca 2 + fluorescens. Den røde fluorescens tilbyr også muligheten for å visualisere det strukturelle fordeling av ER og endringer i ER dynamikk henhold stimulering forhold.

<table border="1">
	 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)</td>
 <td>Tocris</td>
 <td>0805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A26209-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B-27 supplement,50x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbamoylcholine chloride (Charbachol)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C4382-1g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cyclopiazonic acid (CPA)</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM with Glutamax</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>31966-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td>
 <td>PAA</td>
 <td>H15-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>10270-106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamax</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F12 nutrients mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21765-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS</td>
 <td>PAA Laboratories</td>
 <td>H15-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Horse serum</td>
 <td>SHD3250YK</td>
 <td>Linearis</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Ca2+ salt</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-116</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>murine EGF </td>
 <td>PreproTech</td>
 <td>315-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement 100x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal medium</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21103-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P8638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-Lysin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2636</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thapsigargin</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>586005-1mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TryLE Express</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12605-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS-003707</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater controller TC-344B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0101</td>
 <td>to control in line solution heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIH ImageJ software</td>
 <td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N2709100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLFLN40XO</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1478700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1480700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, inverse</td>
 <td>custom-made</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, RC-49FS</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>W4 64-1709 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion tube: PT-49</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1730</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>n.a. </td>
 <td>perfusion pump</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single inline solution heater SH-27B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0102</td>
 <td>controlled by heater controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suction tubes: ST3R</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1407</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td>
 <td>Pecon</td>
 <td>n.a. </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)

Visualisering av kalsium dynamikken er viktig å forstå hvilken rolle kalsium i cellen fysiologi. For å undersøke kalsium dynamikk, har syntetiske fluorescerende Ca 2 + indikatorene blitt populært. Her har vi demonstrere TED (= målrettet esterase-indusert fargestoff lasting), en metode for å forbedre frigjøring av Ca 2 +-indikatoren fargestoffer i ER lumen av forskjellige celletyper. Til dags dato ble benyttet i TED-cellelinjer, gliaceller, nerveceller og in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant målretting av høy karboksylesterase aktivitet til ER lumen bruker vektor-konstruksjoner som uttrykker karboksylesterase (CES). De siste TED vektorer inneholder et kjerneelement i CES2 smeltet sammen til en rød fluorescerende protein, og dermed muliggjør samtidig to-farge bildebehandling. Dynamikken i fritt kalsium i ER er avbildes i én farge, mens tilsvarende ER struktur vises i rødt. Ved begynnelsen av prosessen, brukes-celler transdusert med en lentivirus. Deretter de infiserte celler enre sådd på Dekkglass å endelig gjøre det mulig live-cell imaging. Deretter blir levende celler inkubert med acetoksymetyl ester (AM-ester) form av lav affinitet Ca 2 + indikatorer, for eksempel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, eller Mag-Fura2-AM. Den esterase aktivitet i ER spalter off hydrofobe sidekjeder fra AM-formen av Ca 2 +-indikator og en hydrofil fluorescerende fargestoff / Ca 2 + kompleks dannes og fanget i ER lumen. Etter at fargestoff lasting, blir cellene analysert på en invertert konfokal laser scanning mikroskop. Celler er kontinuerlig perfused med Ringer-lignende løsninger og ER kalsium dynamikk er direkte visualisert ved time-lapse imaging. Kalsium frigjøring fra ER er identifisert ved en nedgang i fluorescens-intensitet i regioner av interesse, mens den påfylling av ER kalsium butikken gir en økning i fluorescensintensiteten. Til slutt, er endringen i fluorescerende intensitet over tid bestemmes ved beregning av A f / F 0.

Denne protokollen gir en ikke-forstyrrende tilnærming for direkte avbildning av gratis ER kalsium. Lav-affinitets syntetisk Ca 2 + indikatorer frigjøres og fanget i ER lumen ved hjelp av en ER målrettet, rekombinant esterase enzymaktivitet. Forbedret lasting av Ca 2 + indikatoren fargestoffer til ER lumen gjør en direkte og rask avbildning av ER kalsium butikken dynamikk. Celletyper for TED Gjennomførbarheten av metoden har blitt vist i ce...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Målrettet-esterase indusert dye lasting (TED) støtter analysen av intracellulære kalsium store dynamikken av fluorescens bildebehandling. Metoden baserer på målretting av en rekombinant karboksylesterase til endoplasmatiske retikulum (ER), hvor det forbedrer den lokale avsløring av syntetisk lav affinitet Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatoren fargestoffer i ER lumen.

Direkte Imaging av ER Kalsium med målrettet-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Uttrykk og rensing av viruslignende partikler for vaksinasjon

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Overvåking av ER / SR-kalsiumfrigivelse med målrettet Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Tenkelig intermediære filamenter og piskehale som henger med 2-dimensjonal direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...