Name: direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) и BL567/3-1 Friedrich-Баур-Stiftung. Мы хотели бы поблагодарить Роджера Y. Tsien, Медицинского института Говарда Хьюза лаборатории в Университете Калифорнии, Сан-Диего за предоставление нам Tag-RFP-T2. Мы признаем счастью Дэвид Балтимор, Калифорнийский технологический институт, Пасадена, и Дидье Trono, Женевский университет, Женева, за предоставление нам лентивирусный плазмид FUGW и psPAX2/pMD2.G.

Этот протокол представляет TED применяется к клеточных линиях, нейронах гиппокампа и кортикальных глиальных клеток. TED производительность лучше всего, когда TED векторов стабильно экспрессируются, например, путем лентивирусов векторов. Схематический обзор метода TED показано на рису...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signaling+in+neurons.">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li><li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+ER+calcium+dynamics.">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li><li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons.">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li><li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Ca2++from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1,4,5-trisphosphate.">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li><li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction.">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+as+cellular+sensors.">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li><li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIMulating+store-operated+Ca(2+)+entry.">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li><li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins.">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li><li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li><li>Sch&#228;uble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca(2+)+leakage+from+the+ER.">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li><li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events.">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li><li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane.">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li><li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses.">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li><li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).</li><li>Lang, S., Sch&#228;uble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca(2)(+)+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms.">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).</li><li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+forward+to+seeing+calcium.">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li><li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators.">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2++concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells.">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li><li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2++oscillations.">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1,4,5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2.">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li><li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum:+an+overview+of+modern+approaches.">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li><li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons:+direct+visualization+of+Ca(2+)-induced+Ca(2+)+release+triggered+by+physiological+Ca(2+)+entry.">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li><li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, (2010).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li><li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes.">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li><li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity.">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li><li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading.">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , (2012).</li></ol>

Преимущества и недостатки метода TED широко обсуждалась в последних публикациях 34,35. По сравнению с другими методами, описанными выше, TED обходит проблему срыва и перфузии клеток. Кроме того, два аспекта необходимо уделять особое внимание. Принцип TED для ER кальций изображений требу?...

Чтобы решить физиологические реакции кальция ER, мы разработали новую стратегию для улучшения захвата синтетических красителей чувствительной к кальцию в ЭР. Метод позволяет напрямую, без прерывания мониторинга в реальном времени свободного кальция ER в присутствии внеклеточного кальция. Функции и сигнализации ER Кальций Кальций сигналы находятся в разных типах клеток, например мышечных клетках, нейроны и глиальные клетки и их функции в диапазоне от посреднических сокращения мышц к участию в синаптической передаче в обучении и памяти 1,2. Изменение концентрации свободного кальция высокой научный интерес, так как кальций участвует в регуляции транскрипции генов, пролиферацию клеток, возбудимость нейронов, гибель клеток и других клеточных сигнальных событий 1-7. Все эти сигналы сотовой кальция функционально связаны и способствуют внутриклеточного кальциямагазин динамики 8-10. Общей особенностью всех кальций сигналов поток кальция между внеклеточным пространством, в цитозоль и органелл, в основном ER и митохондрии. Это вызывает динамическое изменение концентрации кальция в эти органеллы, которые воспринимаются различные компоненты сигнализации. В общем, концентрации кальция в ЭР в диапазоне от 100 до 800 мкМ, в цитозоле концентрации кальция близка к 100 нМ, и во внеклеточном пространстве концентрация составляет около 1-2 мм. Соответственно, существует высокая движущая сила химической кальция течь к цитозоле 2,9,10. Наиболее широко исследованы ЭР-производных сигналов кальция зависит от стимуляции G-белками рецепторы (GPCR), которые затем активируют фосфолипазу С (PLC). PLC в свою очередь производит инозитол 1,4,5-трифосфата (IP 3) 1. После связывания IP 3 до своей RECeptor (IP 3-Rec, рис. 1) в ЭР-мембраны, ионы кальция высвобождаются из просвета ER. Исторически сложилось так, IP 3-опосредованное высвобождение кальция из ER был первым - даже хотя и косвенно - измеряется в ацинарных клеток поджелудочной железы по Streb и др. в 1983 году 11.. В этой публикации предложено в первый раз сигнальный каскад с участием ацетилхолина, фосфолипазы С и IP-3. Таким образом, высвобождения кальция обычно называют IP 3-индуцированный выброс кальция (IiCR) (рис. 1). Киназы-зависимую активацию фосфолипазы сг на рецептор тирозин киназ ссылки действие факторов роста и нейротрофических факторов ER кальциевой сигнализации после IP 3 высоты 12. В дополнение к IiCR, кальций высота может быть опосредовано ионотропную ввод кальций, например, с помощью напряжения закрытого кальциевых каналов (Са V), и последующего кальций-индуцированного высвобождения кальция (CICR) путем повторного рианодиновыхрецепторов (RyR). IiCR CICR и физиологически связаны с магазина управлением поступления кальция (SOCE). SOCE включает действие СТИМ (стромы взаимодействующих молекул), который предназначен для сигнализации выброс кальция, ER. СТИМ было показано, чтобы стимулировать внеклеточной входа кальция через переходный рецепторный потенциал каналов (ГТО) 13, Orai кальциевых каналов 14 и даже напряжения закрытого кальциевых каналов 15 (рис. 1). Потеря кальция ER динамически спасен действие Sarco-эндоплазматический ретикулум кальций АТФазы (SERCA), который активно насосы кальций обратно в ЭР. Блокирование SERCA с такими препаратами, как тапсигаргин представляет непрерывную потерю кальция ER в цитозольный отсека. Это кальций ER &quot;утечка&quot; вызвано ER внутримембранного пор комплексы, такие как Sec61 белкового комплекса 16,17 (рис. 1). В 1998 году опубликовал Berridge модели, &quot;нейрон в модели нейрона&quot;, whicч предполагает принцип физиологической роли ER в интеграции нейронов кальцием 5. Эта модель рассматривает существование непрерывной мембраны ER системы формирования внутриклеточных «образ» мембраны нейронов плазмы 5. Этот бинарный эукариотических мембранной системы как утверждали, было одним из основных условий для временной и пространственной интеграции быстрых и медленных кальциевых сигналов в нейронах. Кальций сигналы, возникающие или одновременно или последовательно в разных шипами или дендритов одного и того же нейрона присвоено сомы клетки или ядра через ER, где они суммируются 5,18. Затем их сумма может оказывать действие на возбудимость нейронов, регуляцию транскрипции гена или интеграции сигнальных каскадов. Таким образом, ER поддерживает интеграцию кальций сигналов. Одной из предпосылок этой концепции является непрерывность ER в одной ячейке, которая была претендуют несколько исследований и который был доказан, по крайней мере для сомато-Dendritic районов и короткого расстояния проекции аксональное 19-21. Есть ли ER непрерывности в течение долгих аксональное прогнозов является предметом дискуссий. Стратегии для измерения расхода свободного кальция через мембрану ER Кальций сигналы наиболее часто контролироваться в цитозоле 22,23. Таким образом, она не может быть легко выделено ли Са 2 + течет в цитозоль из внеклеточной или из внутриклеточных депо 6,24. Чтобы преодолеть это ограничение, методические стратегии для прямой визуализации кальция ER были разработаны. Таким образом, следующие стратегии используются: (1) ER-целевых генетически модифицированных белков-индикаторов 25-27 на основе белков низким сродством Са 2 + индикаторы используют биолюминесцентного белка GFP аэкворин или в комбинации с кальцием чувствительного белка.. Эти генетически модифицированные Ca 2 + индикаторы (GECIS) можетбыть направлены на ER с помощью сигнального пептида и активно хранится в ER помощью удержания и извлечения мотива. Общие ER Ca 2 + индикаторы базы по принципу Cameleon и Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon раскол YC7.3ER 29 и Cameleon D1 30. (2) Прямая эстераза основе красителя АМ-эфира низкоаффинными Ca 2 + 31,32 показателей. AM-производных индикаторов красителей (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM или Fluo5N-AM) проходят биологические мембраны в липофильном, кальция-нечувствительными государства. Затем в цитозоле, а также в ЭР, эндогенные эстераз расщепляют на АМ-эфирной группы и отпустить Са 2 + индикатор, оставляя за определенное количество активного красителя в цитозоле и в ЭР. Таким образом, этот подход полезен в условиях высокой концентрации кальция в ЭР тех пор, пока концентрация цитозольного кальция остается значительно ниже дезащита предел низким сродством показателей, в частности, во время характерные сигналы кальция (например нМ до низкого мкМ). (3) AM-эфир нагрузки в сочетании с плазматической мембраной проницаемости 32. Любой оставшийся цитозольного Ca2 + индикатор удаляется плазматической мембраны проницаемости с небольшим количеством «мягкий» моющего средства (например, сапонин) в искусственной внутриклеточный буфера. Таким образом, внутриклеточных мембран можно стимулировать, например, с IP-3 внутриклеточной буфер, непосредственно через «поры» в плазматической мембране. (4) Диализ цитозоле при цельноклеточной конфигурации и одновременное измерение Са 2 + в просвете ER и цитозоле 32,33. Клетки сначала загружается с низким сродством Са 2 + индикатор (например, Mag-Fura2- AM, радиометрический, УФ-светом). Затем с помощью пипетки патч, оставшиеся цитosolic низким сродством Са 2 + индикатор диализу из цитозоле буфером, содержащим высокое сродство Са 2 + индикатор (например, Fluo-3, видимый свет). Такая стратегия позволяет одновременную запись и цитозольные ER полученных сигналов. (5) Целевые эстеразы-индуцированной красителем 8,34. Карбоксилэстеразы (CES) предназначен для просвете ER и обеспечивает высокую активность эстеразы для эффективного захвата АМ-форме сложного эфира с низким сродством Са 2 + показателей. Целевые эстеразы-индуцированной красителем (TED) Для повышения адресности с низким сродством Ca 2 + показатели ER просвет, Тед был разработан. TED требует избыточной экспрессии ER целевых мышь карбоксилэстеразы (CES2) (рис. 2), которая достигается с помощью экспрессионных конструкций. Клетки, экспрессирующие рекомбинантный CES-конструкцию инкубируют с АМ-сложноэфирной формы кальцияиндикатором красителя (Fluo5N-AM, рисунок 2). Затем в ER, краситель превращается в Са 2 + чувствительным, непроницаемой мембраны Са 2 + индикатор комплекс (Fluo5N/Ca 2 +) на высокую активность эстеразы, поэтому захвата красителя в высокой концентрации в просвете ER 8 , 34. Этот метод особенно полезен для исследования ER кальцием высвобождение через IiCR-путей, например, с помощью метаботропного, пуринергической или глутаматных рецепторов, 8,34 и визуализировать ER кальция истощения через &quot;утечки каналы&quot; непосредственно, например, после блокады SERCA 17 , 34. Нашему опыту низкоаффинными Ca 2 + индикатор Fluo5N-AM в настоящее время является лучшим индикатором доступны для использования с загрузкой стратегии TED красителя. Fluo5N-AM имеет низкий сродство к Са 2 + (константа диссоциации K D ~ 90 мкм, рисунок 2), почти не флуоресцентные в AM-форме, но обеспечивает высокую флуоресценцию излучения при Calciuм 8,34 обязательными. Fluo5N/Ca 2 + комплекс может возбуждаться с помощью стандартного источника света ~ 490 нм, что соответствует стандартным красители, такие как FITC, Alexa 488 или УЗФБ. Цитозольного сигнала кальций едва ли достичь концентрации в диапазоне низких мкМ и, следовательно, едва обнаружено Fluo5N в цитозоле 35. Чтобы повысить производительность Тед, несколько рекомбинантных векторных конструкций были разработаны (рис. 3). Первоначально, Тед векторы на основе кодирующей последовательности CES2 (RefSeq инвентарным номером NM_145603, CES2c) и лучший TED производительности наблюдается при стабильной экспрессии конструкций ЕЭП. Новые векторы TED выразить одним из основных элементов CES2 слит с красной флуоресценции белков TagRFP-T2 36. Эти векторы имеют то преимущество, что они могут быть использованы для идентификации трансдуцированных клеток, а также использовать красную флуоресценцию в качестве внутреннего контроля для нормализации изменений в Fluo5N/Ca 2 + флуоресценции. Красной флуоресценции также дает возможность визуализировать структурные распределение ER и изменения в ER динамики при стимуляции условий.

<table border="1">
	 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)</td>
 <td>Tocris</td>
 <td>0805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A26209-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B-27 supplement,50x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbamoylcholine chloride (Charbachol)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C4382-1g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cyclopiazonic acid (CPA)</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM with Glutamax</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>31966-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td>
 <td>PAA</td>
 <td>H15-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>10270-106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamax</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F12 nutrients mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21765-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS</td>
 <td>PAA Laboratories</td>
 <td>H15-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Horse serum</td>
 <td>SHD3250YK</td>
 <td>Linearis</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Ca2+ salt</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-116</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>murine EGF </td>
 <td>PreproTech</td>
 <td>315-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement 100x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal medium</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21103-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P8638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-Lysin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2636</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thapsigargin</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>586005-1mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TryLE Express</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12605-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS-003707</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater controller TC-344B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0101</td>
 <td>to control in line solution heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIH ImageJ software</td>
 <td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N2709100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLFLN40XO</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1478700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1480700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, inverse</td>
 <td>custom-made</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, RC-49FS</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>W4 64-1709 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion tube: PT-49</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1730</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>n.a. </td>
 <td>perfusion pump</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single inline solution heater SH-27B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0102</td>
 <td>controlled by heater controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suction tubes: ST3R</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1407</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td>
 <td>Pecon</td>
 <td>n.a. </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)

Визуализация динамики кальция важно понимать роль кальция в физиологии клетки. Для изучения динамики кальция, синтетический флуоресцентного Са 2 + индикаторов стали популярными. Здесь показано, TED (= целевых-эстеразы индуцированного красителем), способ улучшить высвобождение Са 2 + индикатор красителей в просвете ER из различных типов клеток. На сегодняшний день TED был использован в клеточных линиях, глиальные клетки, и нейронов в пробирке. TED баз на эффективную, рекомбинантные адресности высокой активностью карбоксилэстеразы в просвете ER использованием векторной конструкции, которые выражают карбоксилэстеразы (CES). Последнее TED векторы содержат основной элемент CES2 слит с красным флуоресцентным белком, что позволяет одновременное двухцветные изображения. Динамика свободного кальция в ЭР в образ будут включены в один цвет, а соответствующие структуры ER отображается красным цветом. В начале процедуры клеток, трансдуцированных лентивирусов. Затем инфицированные клеткиRe высевали на покровные, наконец, позволить изображений живых клеток. Затем живые клетки инкубируют с ацетоксиметил эфир (AM-эфир) формы с низким сродством Са 2 + показателей, например Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM или Mag-Fura2-AM. Эстеразы деятельности в расщепляет ER от гидрофобных боковых цепей от AM форме Са 2 + индикатор и гидрофильные флуоресцентного красителя / Ca 2 + образуется комплекс и захваченных в ЭР просвет. После загрузки краситель, клетки анализируют на перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клетки постоянно озарен Ringer-подобные решения и ER динамики кальция непосредственно визуализируется в заданный промежуток времени. Кальций освобождение от ER идентифицируется снижение интенсивности флуоресценции в регионах, представляющих интерес, в то время заправки из магазина кальция ER приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Наконец, изменение интенсивности флуоресценции во времени определяется путем расчета f / F 0.

Этот протокол обеспечивает без прерывания подход для прямой визуализации свободного кальция ER. Низкоаффинными синтетического Ca 2 + индикаторы выходят в свет и захваченных в просвете ER с помощью ER целевых, рекомбинантные активность фермента эстеразы. Улучшение загрузки Са 2 +</su...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Целевые-эстеразы индуцированного красителем (TED) поддерживает анализ внутриклеточной динамики магазин кальций флуоресцентной визуализации. Метод основан на нацеливание рекомбинантного карбоксилэстеразы в эндоплазматический ретикулум (ER), где она улучшает местный разоблачении синтетический низким сродством Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; Индикатор красителей в ER просвет.

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Экс естественных механические нагрузки сухожилия

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

В Vivo 2-Фотон изображений кальция на уровне 2 / 3 от мышей

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Кальций изображений корковых нейронов использованием Фура-2 утра

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Живая изображений Кальций сотовый В сочетании с миРНК Отключение гена опосредованного Идентифицирует Ca 2 + Утечка каналов в мембране ЭР и их регулирующих механизмов

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Мониторинг высвобождения кальция ER / SR с помощью целевого Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Сенсорный CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание Жёлтый флуоресцентный белок, помеченный p62 в Aggresome-индуцированной структуры

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...