Name: direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 och Friedrich-Baur-Stiftung. Vi vill tacka Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories vid University of California, San Diego för att förse oss med Tag-RFP-T2. Vi erkänner tacksamt David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, och Didier Trönö, University of Geneva, Genève, för att ge oss den lentiviral plasmider FUGW och psPAX2/pMD2.G.

Detta protokoll introducerar TED tillämpas på cellinjer, hippocampus nervceller och kortikala gliaceller. TED prestanda fungerar bäst när TED vektorer uttrycks stabilt, exempelvis genom lentivirusvektorer. En schematisk översikt av TED metod visas i figur 4. Ett. Beredning av lösningar Följande lösningar skall beredas innan och kan lagras som anges. Vi använder vanligtvis steriliserad glas och plastmaterial och autoklaveras vatten. <ol...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signaling+in+neurons.">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling.">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li><li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release.">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li><li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+ER+calcium+dynamics.">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li><li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons.">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li><li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Ca2++from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1,4,5-trisphosphate.">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li><li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On/off-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction.">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+as+cellular+sensors.">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li><li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIMulating+store-operated+Ca(2+)+entry.">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li><li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins.">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li><li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li><li>Sch&#228;uble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca(2+)+leakage+from+the+ER.">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li><li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events.">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li><li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane.">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li><li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses.">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li><li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).</li><li>Lang, S., Sch&#228;uble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca(2)(+)+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms.">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).</li><li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+forward+to+seeing+calcium.">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li><li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators.">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2++concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells.">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li><li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications.">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li><li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2++oscillations.">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1,4,5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2.">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li><li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum:+an+overview+of+modern+approaches.">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li><li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons:+direct+visualization+of+Ca(2+)-induced+Ca(2+)+release+triggered+by+physiological+Ca(2+)+entry.">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li><li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, (2010).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li><li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes.">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li><li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity.">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li><li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading.">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , (2012).</li></ol>

Fördelarna och nackdelarna med TED metoden har diskuterats flitigt de senaste publikationerna 34,35. Jämfört med andra metoder som beskrivs ovan, kringgår TED problemet att störa och perfusion av cellerna. Dessutom två aspekter måste understrykas. Principen om TED för ER kalcium avbildning kräver (1.) Den riktade uttryck för en aktiv karboxylesteras i ER lumen med hjälp av TED vektorkonstrukt och (2.) En effektiv och förmånlig frisättning av låg affinitet syntetiska AM-estrar av kalcium färgä...

För att lösa fysiologiska kalcium svaren från ER, utvecklade vi en ny strategi för att förbättra fångst av syntetiska kalcium känsliga färgämnen till ER. Metoden möjliggör direkta, icke-störande realtidsövervakning av fri ER kalcium i närvaro av extracellulärt kalcium. Funktion och signalering av ER Kalcium Kalcium-signaler finns i olika celltyper, t.ex. muskel-celler, neuroner och gliaceller och deras funktioner varierar från medla muskelkontraktion till ett engagemang i synaptisk transmission i inlärning och minne 1,2. Förändringar i fritt kalcium koncentrationen är av hög vetenskaplig intresse eftersom kalcium är involverat i regleringen av genen transkription, celldelning, neuronala retbarhet, celldöd och andra cell signalering händelser 1-7. Alla dessa cellulära kalcium signaler funktionellt anslutna och bidra till intracellulär kalciumlagra dynamik 8-10. Ett gemensamt drag hos alla kalcium signaler är flödet av kalcium mellan det extracellulära utrymmet, cytosolen och organeller, främst ER och mitokondrier. Detta orsakar dynamiska förändringar i kalciumkoncentrationen inom dessa organeller, som avkänns av olika signalsystem komponenter. I allmänhet kalciumkoncentrationen i ER varierar mellan 100 och 800 ^ M, i cytosolen kalciumkoncentrationen är nära till 100 nM och i det extracellulära utrymmet koncentrationen är cirka 1-2 mM. Följaktligen finns det en hög kemisk drivkraft för kalcium flöde mot cytosolen 2,9,10. De vanligast undersökta ER-härledda kalcium signaler beror på stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCR), som sedan aktiverar fosfolipas C (PLC). PLC i sin tur producerar inositol 1,4,5-trifosfat (IP3) 1. Vid bindning av IP 3 av sin receptor (IP 3-Rec, figur 1) i ER-membranet, kalciumjoner frigörs från ER lumen. Historiskt sett var IP 3-medierad kalciumfrisättning från ER först - även om indirekt - mätt i acinära bukspottkörtelceller från Streb et al 1983 11.. Denna publikation föreslås för första gången en signaleringskaskad involverar acetylkolin, fosfolipas C, och IP 3. Detta sätt att kalciumfrisättning generellt betecknas IP 3-inducerad kalciumfrisättning (IiCR) (Figur 1). Kinas-beroende aktivering av fosfolipas Cy genom receptortyrosinkinaser tyrosin länkar handlingen av tillväxtfaktorer och neurotrofiska faktorer till ER kalcium signalering efter IP 3 höjd 12. Förutom IiCR, kan kalcium höjd förmedlas genom jonotropisk kalcium posten, till exempel via spänningsstyrda kalciumkanaler (Ca V), och efterföljande kalcium-inducerad kalcium frisättning (CICR) genom ryanodine receptors (Ryr). IiCR och CICR är fysiologiskt kopplade till affären-drivs kalcium Entry (SOCE). SOCE innefattar verkan av Stim (stroma interagerande molekyl), som är en sensor för ER kalciumfrisättning. Stim har visats stimulera extracellulärt kalcium inlägg via Transient Receptor Potential kanaler (Trp) 13, Orai kalciumkanaler 14 och till och med spänningsstyrda kalciumkanaler 15 (Figur 1). Förlust av ER kalcium dynamiskt räddas genom inverkan av Sarco-endoplasmatiska nätverket kalcium ATPas (SERCA), som aktivt pumpar kalcium tillbaka till akuten. Blockering av SERCA med droger liksom thapsigargin lanserar en kontinuerlig förlust av ER kalcium till cytosola facket. Denna ER kalcium &quot;läcka&quot; är orsakad av ER-komplex intramembrane porstorlek såsom Sec61 proteinkomplexet 16,17 (figur 1). År 1998 publicerade Berridge en modell, den &quot;neuron inom en neuron modell&quot;, which föreslår en princip fysiologisk roll för ER att integrera neuronala kalcium 5. Denna modell anser att det finns ett kontinuerligt ER membran systemet bildar en intracellulär &quot;bild&quot; av den neuronala plasmamembranet 5. Denna binära eukaryot membran system påstås vara en grundläggande förutsättning för tidsmässig och rumslig integration av snabba och långsamma kalcium signaler i nervceller. Kalcium signaler som uppträder antingen samtidigt eller senare i olika ryggar eller dendriter av samma neuron har tilldelats till cellens soma eller kärna via ER, där de summeras 5,18. Då kan deras summa ha effekter på retbarhet av neuron, reglering av gentranskription eller integration av signalkaskader. Sålunda stöder ER integrationen av kalcium signaler. En förutsättning för detta koncept är kontinuiteten av ER i en enda cell, vilket har hävdats av flera studier och som har visat minst för somato-dendritic områden och korta avstånd axonal prognoser 19-21. Huruvida det är ER kontinuitet inom långa axonal prognoser är en fråga för debatt. Strategier för att mäta flödet av fritt kalcium över ER-membranet Kalcium signaler oftast övervakas i cytosolen 22,23. Därför kan det inte lätt särskiljas huruvida Ca 2 + strömmar in i cytosolen från extracellulära eller från intracellulära förråd 6,24. För att övervinna denna begränsning, har metodologiska strategier för direkt ER kalcium avbildning utvecklats. Sammanfattningsvis är följande strategier användas: (1) ER-riktade genmanipulerade protein-indikatorer 25-27 Protein-baserade låg affinitet Ca2 + indikatorer använder bioluminescensprotein aequorin eller GFP i kombination med en kalciumavkännande protein.. Dessa genetiskt manipulerade Ca2 + indikatorer (GECIs) kanriktas till ER med hjälp av en signalpeptid och aktivt hålls i ER med hjälp av en kvarhållande och hämtning motiv. Gemensam ER Ca 2 + indikatorer bas på Cameleon principen och är Cameleon YC4.3 26,28, Cameleon split YC7.3ER 29, och Cameleon D1 30. (2) Direkt esterasalstrande baserad färgämne lastning av AM-ester med låg affinitet Ca2 + indikatorerna 31,32. AM-derivat av indikatorfärgämnen (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passera biologiska membran i en lipofil, kalcium-okänsliga tillstånd. Sedan, i cytosolen liksom i ER, endogena esteraser spjälkar av AM-estergruppen och släpp Ca 2 + indikator och lämnar efter sig en viss mängd aktiv färgämne i cytosolen och i ER. Därför är denna metod användbar under betingelser av en hög kalciumkoncentration i ER, så länge som den cytosoliska kalciumkoncentrationen stannar långt under deskydd gränsen för låg affinitet indikatorer, särskilt under karakteristiska kalcium signaler (t.ex. nM till låga iM). (3) AM-ester lastning i kombination med plasmamembranet permeabilization 32. Eventuellt kvarvarande cytosoliskt Ca 2 + indikator avlägsnas genom plasmamembranet permeabilisering med små mängder av en &quot;mild&quot; rengöringsmedel (t.ex. saponin) i en artificiell intracellulär buffert. Således kan de intracellulära membran stimuleras, t.ex. med IP 3 i den intracellulära buffert, direkt via &quot;porer&quot; i plasmamembranet. (4) Dialys i cytosolen i hela cellkonfiguration och samtidiga mätningar av Ca2 + i ER lumen och cytosolen 32,33. En cell laddas först med en låg affinitet Ca 2 + indikator (t.ex. Mag-fura2- AM, kvotmetriska, UV-ljus). Efteråt, med hjälp av en patch pipett, eventuella kvarvarande cytosolic låg affinitet Ca 2 + indikator dialyseras ut ur cytosolen med en buffert innehållande en hög affinitet Ca 2 + indikator (t.ex. Fluo-3, synligt ljus). Denna strategi möjliggör samtidig inspelning av cytosolic och ER härledda signaler. (5) Riktad-esterasalstrande inducerad färgämnesbelastning 8,34. En karboxylesteras (CES) är riktad mot lumen av ER och ger en hög esterasaktiviteten för effektiv infångning av AM-ester form av låg affinitet Ca2 + indikatorer. Riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED) För att förbättra inriktning av låg affinitet Ca2 + indikatorer till ER lumen, var TED utvecklades. TED kräver överuttryck av en målinriktad ER mus karboxylesteras (CES2) (Figur 2), vilket uppnås via expressionskonstruktioner. Celler som uttrycker en rekombinant CES-konstruktionen inkuberas med AM-ester form av en kalcium iIndikatorn färgämne (Fluo5N-AM, figur 2). Sedan, i ER, är färgämnet omvandlas till Ca 2 + känslig, membran impermeabelt Ca 2 + indikator komplex (Fluo5N/Ca 2 +) av den höga esterasaktiviteten därför fånga färgämnet i en hög koncentration i ER lumen 8 , 34. Metoden är speciellt användbar för att undersöka ER kalcium-frisättning via IiCR-banor för exempel via metabotropiska, purinerga-eller glutamat-receptorer 8,34 och att visualisera ER kalcium utarmning via &quot;Läcka kanaler&quot; direkt, exempelvis efter blockad av SERCA 17 , 34. Till vår erfarenhet med låg affinitet Ca 2 + indikator Fluo5N-AM är för närvarande den bästa tillgängliga indikatorn för användning med TED färgämnesbelastning strategi. Fluo5N-AM har en låg affinitet för Ca2 + (dissociationskonstant K D ~ 90 ^ M, figur 2), är nästan icke-fluorescerande i sin AM-formen, men ger hög fluorescensemission vid Calcium bindning 8,34. Den Fluo5N/Ca 2 + komplexet kan exciteras med en vanlig ljuskälla med ~ 490 nm, vilket motsvarar vanliga färgämnen såsom FITC, Alexa 488, eller EGFP. Cytosoliska kalcium signalerna når knappast en koncentration i det låga pM intervallet och är därför knappt detekteras genom Fluo5N i cytosolen 35. För att förbättra prestanda TED har flera rekombinanta vektorkonstruktioner utvecklade (Figur 3). Ursprungligen är TED vektorer baserade på den kodande sekvensen för CES2 (RefSeq accessionsnummer NM_145603, CES2c) och bästa TED prestanda observerades med stabilt uttryck av CES konstruktioner. Nya TED vektorer uttrycker en central del av CES2 sammansmält med röda fluorescerande protein TagRFP-T2 36. Dessa vektorer har den fördelen att de kan användas för att identifiera omvandlade celler och att använda röd fluorescens som en intern kontroll för normalisering av förändringar i Fluo5N/Ca 2 + fluorescens. Den röda fluorescens erbjuder också möjligheten att visualisera den strukturella fördelningen av ER och förändringar i ER dynamik enligt stimulering förhållanden.

<table border="1">
	 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)</td>
 <td>Tocris</td>
 <td>0805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A26209-1G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B-27 supplement,50x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbamoylcholine chloride (Charbachol)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C4382-1g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cyclopiazonic acid (CPA)</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM with Glutamax</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>31966-047</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td>
 <td>PAA</td>
 <td>H15-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>10270-106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamax</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F12 nutrients mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21765-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS</td>
 <td>PAA Laboratories</td>
 <td>H15-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Horse serum</td>
 <td>SHD3250YK</td>
 <td>Linearis</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Ca2+ salt</td>
 <td>Ascent scientific</td>
 <td>Asc-116</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>murine EGF </td>
 <td>PreproTech</td>
 <td>315-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N2 supplement 100x</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal medium</td>
 <td>Invitrogen-Gibco</td>
 <td>21103-049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P8638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-Lysin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2636</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thapsigargin</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>586005-1mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TryLE Express</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12605-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS-003707</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>user-specific configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater controller TC-344B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0101</td>
 <td>to control in line solution heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIH ImageJ software</td>
 <td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N2709100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLFLN40XO</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1478700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>N1480700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, inverse</td>
 <td>custom-made</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber, RC-49FS</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>W4 64-1709 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion tube: PT-49</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1730</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>n.a. </td>
 <td>perfusion pump</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single inline solution heater SH-27B</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-0102</td>
 <td>controlled by heater controller</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suction tubes: ST3R</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>64-1407</td>
 <td>for perfusion</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td>
 <td>Pecon</td>
 <td>n.a. </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

direct imaging of er calcium with targeted-esterase induced dye loading (ted)

Visualisering av kalcium dynamik är viktigt att förstå betydelsen av kalcium i cellen fysiologi. För att undersöka kalcium dynamik, har syntetiska fluorescerande Ca 2 + indikatorer blivit populär. Här visar vi TED (= riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning), en metod för att förbättra frigörandet av Ca 2 + indikatorfärgämnen i ER lumen hos olika celltyper. Hittills har TED används i cellinjer, gliaceller och nervceller in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant inriktning av en hög karboxylesteras aktivitet till ER lumen med hjälp av vektor-konstruktioner som uttrycker Carboxylesterases (CES). De senaste TED vektorer innehåller en central del av CES2 sammansmält till ett rött fluorescerande protein, vilket möjliggör simultan två-färgbilder. Dynamiken i fritt kalcium i ER avbildas i en färg, medan motsvarande ER strukturen visas i rött. I början av förfarandet, celler omvandlas med en lentivirus. Därefter de infekterade cellerna enre ympades på täckglas att äntligen möjliggöra levande cell imaging. Därefter levande celler inkuberas med acetoximetylester (AM-ester) form av låg affinitet Ca2 + indikatorer, exempelvis Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, eller Mag-fura2-AM. Esterasaktiviteten i ER klyver utanför hydrofoba sidokedjor från AM formen av Ca2 +-indikator och en hydrofil fluorescerande färgämne / Ca2 + komplex bildas och fastnar i ER lumen. Efter färgämnesbelastning, cellerna analyseras på en inverterad konfokalt laserscanning mikroskop. Celler kontinuerligt perfusion med Ringer-liknande lösningar och ER kalcium dynamik är direkt visualiseras genom time-lapse avbildning. Kalcium frisättning från ER identifieras genom en minskning i fluorescensintensitet i regioner av intresse, medan påfyllning av ER kalcium butiken ger en ökning av fluorescensintensitet. Slutligen, är förändringen i fluorescerande intensitet över tiden bestäms genom beräkning av AF / F 0.

Detta protokoll ger en icke-störande metod för direkt avbildning av fri ER kalcium. Låg affinitet syntetisk Ca 2 + indikatorer släpps och fångade i ER lumen med hjälp av en riktad ER, rekombinant esteras enzymaktivitet. Förbättrad lastning av Ca2 + indikatorfärgämnen till ER lumen möjliggör en direkt och snabb avbildning av ER dynamik kalcium butik. Celltyper för TED Genomförbarheten av metoden har visat i de cellinjer BHK21, HEK2...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED at JoVE.com

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED) stödjer analys av intracellulära dynamik kalcium butik genom fluorescens avbildning. Metoden baserar på en inriktning av en rekombinant karboxylesteras till det endoplasmatiska retiklet (ER), där det förbättrar den lokala demaskera av syntetiskt låg affinitet Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatorfärgämnen i ER lumen.

Direkt avbildning av ER Kalcium med riktade-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Ex vivo mekanisk belastning av senan

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Laddar Drosophila nervterminaler med kalcium indikatorer

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

In Vivo 2-Photon Kalcium Imaging i Layer 2 / 3 av Möss

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Kalcium Imaging av kortikal nervceller med Fura-2:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Levande cell Kalcium Imaging Kombinerat med siRNA Medierad geners uttryck Identifierar Ca 2 + Läckage kanaler i ER membranet och deras regleringsmekanismer

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Expression och rening av virusliknande partiklar för Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Övervakning av ER / SR-kalciumfrisättning med den riktade Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging intermediär filament och mikrotubuli med 2-dimensionell direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens återhämtning efter Fotoblekning av gula fluorescerande Protein taggade p62 i Aggresome-liknande inducerad strukturer

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...