Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

Vi takker Anne-Marie Dion-Cote for diskussioner, der fører til udviklingen af ​​metoden. JK og RB er FQNRT ph.d. lærde, M.-MG er en Vanier CIHR lærd og J.-YM er et FRSQ seniorforsker. Dette arbejde blev støttet af midler fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd til JY. M.

1.. Produktion af rekombinant Baculovirus Baculovira genereres ved hjælp af Bac-til-Bac baculovirusekspressionssystemet Invitrogen hovedsagelig i overensstemmelse med producentens protokol med kun små modifikationer: <ol><li> En modificeret pFastBac1 vektor (Gibco, livet) blev oprettet, der indeholder GST og His-tags (figur 2). Multikloningsstedet (MCS) af et pET-52b (+)-vektoren (Novagen), indeholder et 10xHis-tag, blev indsat i MCS af pFastBac1 vektor for at generere p...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

GST-Hans oprensningsprotokol præsenteres her, er egnet til rensning af en bred vifte af størrelser af rekombinante proteiner: Vi har med held renset Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa) PALB2 (130kDa), og en ustabil høj molekylvægt protein Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Desuden proteiner oprenset med denne protokol var biokemisk aktive 6. Succesen for denne metode afhænger udelukkende af udtrykket, opløselighed og stabilitet det ønskede protein. <p class="jov...

Rensningen af ​​rekombinante proteiner er afgørende for at løse fundamentale spørgsmål i biokemi. Konventionelle måder til proteinoprensning såsom ionbytningskromatografi og gelpermeationskromatografi afhængige fysiske egenskaber af målproteinet såsom dens isoelektriske punkt og ladning eller størrelse, hhv. Sidstnævnte protein egenskaber deles af en række proteiner, som øger væsentligt chancen for kontaminerende proteiner i konventionelle proteinoprensningsfremgangsmåder strategier. Dette problem kan omgås ved anvendelse af flere oprensningssøjlerne, hvilket er tidskrævende. Samtidig, sidstnævnte kromatografifremgangsmåder kræver dyre forsøgsopstilling. Affinity-tag rensning kraftigt øger target-specificitet, som i de fleste tilfælde tag vil være unikke for proteinet af interesse. I de seneste undersøgelser har Flag-eller HA-affinitetsoprensning været meget anvendt. I modsætning til eksisterende recombinant protein oprensningsprotokoller hvor enkelt tags bruges etablerede vi en unik kombination af to tags. Vores fremgangsmåde involverer fusionen af ​​et GST-tag i N-terminalen og en His-tag ved C-terminalen af ​​proteinet af interesse, til et optimalt forhold mellem mængden og renheden af ​​det ønskede protein. GST er en lang tag (29 kDa), som er meget effektiv til oprensning på glutathion Sepharose-perler. Desuden ved hjælp af GST garanterer omkostningseffektiviteten af vores metode 1. Muligheden for at fraspalte GST med PreScission enzym (med genkendelsessekvens LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, hvilket resulterer i tilføjelsen af ​​kun to aminosyrer) har mange fordele, for eksempel, denne strategi undgår ændringer i de fysiologiske proteinet fungerer på grund allosterisk hindring. Den lille His-mærke fusioneret til det andet protein ende tjener et andet oprensningstrin til at øge protein renhed ved afvaskning det spaltede GST samt nedbrydes proteiner og andre<html> forurenende stoffer. Derudover betyder protokollen ikke kræver en dialyse skridt, når der skiftes fra GST til His-oprensningstrinnet kolonne (TALON harpiks). Fælles forurenende stoffer i sådanne rensningsprocesser er varmechokproteiner (HSP). Tilføjelsen af et inkubationstrin med MgCl2 og ATP giver fjernelsen af disse stoffer (Figur 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er almindelige teknikker, der er afhængige af dyre instrumenter at generere højt udbytte af det rensede protein af interesse. Den batch oprensningsprotokol vi præsenterer her, derimod, er manuel og kræver ikke et dyrt instrumental setup. Et højt udbytte af protein kan nås ved at opskalere protokollen. Samtidig med batch oprensningsprotokollen, elueringsvolumenet kan justeres for at øge proteinkoncentration, der ikke er givet med FPLC eller HPLC. ntent &quot;&gt; Også med batch GST-His oprensningsprotokol, proteiner med en størrelse-række ~ 10-300 kDa kan oprenses. En af de største fordele er givet ved det faktum, at man kan oprense adskillige proteiner på samme tid for eksempel både en vildtype-og mutant-protein. succes præsenterede protokol afhænger udelukkende af ekspressionsniveauet og opløseligheden af ​​proteinet af interesse.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Vigtige assays i enzymologi til biokemisk karakterisering af proteiner in vitro kræver høje koncentrationer af det rensede protein af interesse. Protein oprensningsprotokoller bør kombinere effektivitet, enkelhed og omkostningseffektivitet 1.. Her beskriver vi GST-Hans metode som ny mindre affinitetsoprensning for rekombinante proteiner, der er baseret på en N-terminal glutathion Sepharose Tag (GST) 2,3 og en C-terminale 10xHis tag 4, som begge er fusioneret til proteinet af interesse. Sidstnævnte konstruktion anvendes til at generere baculovira for infektion af Sf9-inficerede celler til proteinekspression 5. GST er en temmelig lang tag (29 kDa), som tjener til at sikre rensningseffektivitet. Det kan imidlertid påvirke fysiologiske egenskaber af proteinet. Derfor er det spaltes efterfølgende fra proteinet ved hjælp af PreScission enzymet 6. For at sikre maksimal renhed og fjerne det spaltede GST, vitilføjet en anden affinitetsoprensningstrin baseret på forholdsvis lille His-Tag. Vigtigere er vores teknik baseret på to forskellige mærker, der flankerer de to ender af proteinet, som er et effektivt værktøj til at fjerne nedbrudte proteiner, og derfor beriger proteiner i fuld længde. Den præsenteres her metode kræver ikke et dyrt instrumental opsætning, såsom FPLC. Desuden har vi indarbejdet MgCI2 og ATP vasker for at fjerne varmechokprotein urenheder og nucleasebehandling at afskaffe kontaminerende nukleinsyrer. Sammenfattende kombinationen af ​​to forskellige mærker, der flankerer den N-og den C-terminale og evnen til at fraspalte en af ​​de koder, garanterer tilbagebetaling af en højt oprenset og fuld-længde protein af interesse.

For at illustrere effektiviteten af GST-His oprensningsprotokol vi oprenset Rec14 en S. pombe protein på 32,9 kDa. Den Rec14 cDNA blev klonet i vores modificeret pFastBac1 vektor tillader tilføjelserne af GST-og His-tags ved N-og C-terminale ende (figur 1A). Rekombinante baculovirus blev derefter fremstillet og anvendt til at inficere SF9-inficerede celler til proteinekspression. De opløselige cellelysater blev inkuberet med GST-perler og bundet-proteiner blev elueret ved spaltning GST med P...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

I den foreliggende protokol, viser vi en yderst effektiv og omkostningseffektiv små proteinoprensning metode, som tillader oprensning af rekombinante proteiner ved entydigt at kombinere en spaltelig GST-tag og en lille His-mærke.

GST-Hans oprensning: En to-trins Affinitetsrensning protokollen Efterlevelse fuld længde oprensede proteiner

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografisk Rensning af højaktiv Gær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonale Proteinoprensning Faciliteret af en lille Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifikation af Protein Interagerende Partners Brug Tandem Affinitetsrensning

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Oprensning af Affinity-mærkede rekombinante proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri metode til Binding Affinity Bestemmelse ved Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifikation af protein-protein interaktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Voksen Heads af Tandem Affinitetsrensning (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...