Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

Wij danken Anne-Marie Dion-Cote voor beraadslagingen die leiden tot de ontwikkeling van de methode. JK en RB zijn FQNRT doctorale geleerden, M.-MG is een Vanier CIHR geleerde, en J.-YM is een FRSQ senior onderzoeker. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Natural Sciences and Engineering Research Council om JY. M.

1. Productie van Recombinant Baculovirus Baculovirussen worden gegenereerd met de Bac-to-Bac Baculovirus Expression System van Invitrogen voornamelijk volgens protocol van de fabrikant met slechts geringe wijzigingen: <ol><li> Een gewijzigde pFastBac 1 vector (Gibco, leven) werd opgericht met de GST en His-labels (figuur 2). De multikloneringsplaats (MCS) van een PET-52b (+) vector (Novagen), met daarin een 10xHis-tag, werd ingebracht in de MCS van een pFastBac 1 vector om...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

De GST-His zuiveringsprotocol hier gepresenteerde geschikt voor de zuivering van een breed gebied van afmetingen van recombinant eiwit: We succesvol gezuiverd Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), en een instabiele hoog molecuulgewicht eiwit Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Bovendien, de eiwitten gezuiverd met dit protocol waren biochemisch actief 6. Het succes van deze werkwijze hangt uitsluitend af van de expressie, oplosbaarheid en stabiliteit van het g...

De zuivering van recombinante eiwitten is cruciaal om fundamentele vragen in de biochemie aan te pakken. Gebruikelijke manieren eiwitzuivering zoals ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie afhankelijk fysische eigenschappen van het doeleiwit zoals de iso-elektrische punt en heffingen of grootte, respectievelijk. Deze proteïne kenmerken gedeeld door een verscheidenheid van eiwitten, die aanzienlijk de kans verontreinigende proteïnen in gebruikelijke eiwitzuivering strategieën toe. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van meerdere kolommen zuivering, hetgeen tijdrovend. Tegelijkertijd, deze chromatografie methoden vereisen dure experimentele opstelling. Affiniteit-zuivering tag sterk toeneemt doel-specificiteit, zoals in de meeste gevallen het label uniek het eiwit van belang zijn. In recente studies is vlag-of HA-affiniteitszuivering grote schaal gebruikt. In tegenstelling tot bestaande recombinant eiwitzuivering protocollen waarin enkele tags worden gebruikt, hebben we de unieke combinatie van twee tags. Onze werkwijze omvat de fusie van een GST-tag aan de N-terminus en een His-tag aan het C-uiteinde van het eiwit van belang, voor een optimale verhouding tussen de hoeveelheid en zuiverheid van het gewenste eiwit. De GST is een lange markering (29 kDa), die zeer efficiënt voor zuivering op glutathion Sepharose kralen. Bovendien gebruiken GST garandeert kosteneffectiviteit van onze methode 1. De mogelijkheid splitsen van de GST met PreScission enzym (met herkenningssequentie LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, waardoor de toevoeging van twee aminozuren) heeft vele voordelen, bijvoorbeeld, en vermijdt veranderingen van de fysiologische functies eiwit door allosterische belemmering. De kleine His-tag gefuseerd met het andere eiwit uiteinde dient in een tweede zuiveringsstap eiwit zuiverheid te verhogen door het wassen van de gesplitste GST, alsmede afgebroken eiwitten en andere<html> verontreinigingen. Bovendien wordt het protocol geen dialyse stap nodig bij het overschakelen van de GST naar de kolom Zijn-zuiveringsstap (TALON hars). Gemeenschappelijke verontreinigingen dergelijke zuiveringswerkwijzen zijn heat shock eiwitten (HSP). De toevoeging van een incubatiestap met MgCl2 en ATP maakt de verwijdering van deze verontreinigingen (figuur 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zijn gangbare technieken die afhankelijk zijn van dure instrumentatie hoge opbrengst van het gezuiverde eiwit van belang te genereren. De batch zuiveringsprotocol hier geïntroduceerde daarentegen is handmatig en niet dure instrumentele opstelling vereist. Een hoge opbrengst van eiwit kan worden bereikt door het opschalen van het protocol. Tegelijkertijd, partijnummer zuiveringsprotocol, het elutievolume kan worden aangepast om eiwitconcentratie, die niet wordt gegeven met FPLC en HPLC verbeteren. ntent &quot;&gt; Ook, partijnummer GST-His zuiveringsprotocol, eiwitten met een grootte-bereik van ~ 10-300 kDa kunnen worden gezuiverd. Een van de grootste voordelen is gegeven door het feit dat een aantal eiwitten kunnen zuiveren tegelijkertijd bijvoorbeeld, zowel wild-type en de mutante eiwitten. Het succes van de gepresenteerde protocol alleen afhankelijk van het expressieniveau en de oplosbaarheid van het eiwit van belang.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Toets assays Enzymology de biochemische karakterisatie van eiwitten in vitro noodzakelijk hoge concentraties van het gezuiverde eiwit van belang. Eiwitzuivering protocollen te efficiency, eenvoud en kosteneffectiviteit 1 combineren. Hier beschrijven we de GST-His Werkwijze nieuw kleinschalig affiniteit zuiveringssysteem voor recombinante proteïnen, op basis van een N-terminale Glutathion Sepharose tag (GST) 2,3 en een C-terminaal tag 10xHis 4, die beide gefuseerd het eiwit van belang. De laatste construct wordt gebruikt om baculovirussen genereren voor infectie van Sf9-geïnfecteerde cellen voor eiwitexpressie 5. GST is een vrij lange tag (29 kDa) die dient om de zuivering efficiëntie te garanderen. Toch kan het fysiologische eigenschappen van het eiwit te beïnvloeden. Daarom is het vervolgens afgesplitst het eiwit met het enzym PreScission 6. Om maximale zuiverheid te verzekeren en de gesplitste GST te verwijderen, wevoegde een tweede affiniteitszuiveringsfase gebaseerd op de relatief kleine His-tag. Belangrijk is onze techniek waarbij twee verschillende labels aan weerszijden van de twee uiteinden van het eiwit, dat een efficiënt middel om gedegradeerde eiwitten te verwijderen en bijgevolg verrijkt full-length eiwitten. De hier gepresenteerde methode heeft een dure instrumentale setup, zoals FPLC niet nodig. Daarnaast hebben we opgenomen MgCl2 en ATP wast om heat shock protein onzuiverheden en nucleasebehandeling afschaffen verontreinigende nucleïnezuren te verwijderen. Samengevat, de combinatie van twee verschillende labels weerszijden van de N-en C-terminale en de mogelijkheid om splitsen van een van de labels, garandeert het herstel van een sterk gezuiverd en full-length eiwit van belang.

Teneinde de doelmatigheid van de GST-His zuiveringsprotocol illustreren we gezuiverd Rec14 een S. pombe eiwit van 32,9 kDa. De Rec14 cDNA werd gekloneerd in onze gemodificeerde pFastBac 1 vector waardoor de toevoeging van GST-en His-tag aan de N-en C-termini, respectievelijk (figuur 1A). Recombinant baculovirus werden vervolgens bereid en gebruikt om SF9 geïnfecteerde cellen te infecteren voor eiwitexpressie. De oplosbare cellysaten werden geïncubeerd met GST-parels en gebonden eiwitten werde...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...