Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
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Nous remercions Anne-Marie Dion-Côte des discussions menant à l&#39;élaboration de la méthode. JK et RB sont FQNRT chercheurs doctorants, M.-MG est un savant Vanier IRSC, et J.-YM est un chercheur senior du FRSQ. Ce travail a été soutenu par des fonds du Conseil de recherches en génie à JY sciences naturelles et en. M.

Une. Production de baculovirus recombinant Les baculovirus sont générés en utilisant le système d&#39;expression Bac-to-Bac Baculovirus d&#39;Invitrogen principalement en conformité avec le protocole du fabricant avec seulement de légères modifications: <ol><li> Un vecteur pFastBac1 modifié (Gibco, la vie) a été créé contenant la TPS et ses balises (Figure 2). Le site clonage multiple (MCS) d&#39;un animal-52b (+) vecteur (Novagen), contenant un 10xHis-étiquet...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

Le-His TPS protocole de purification présentée ici est approprié pour la purification d&#39;une large gamme de tailles et de protéines recombinantes: Nous avons purifié avec succès Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), et une protéine de haut poids moléculaire instable de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. En outre, les protéines purifiées avec ce protocole étaient biochimiquement active 6. Le succès de ce procédé dépend uniquement de l&#39;ex...

La purification de protéines recombinantes est crucial de répondre aux questions fondamentales de la biochimie. Des moyens classiques de purification des protéines, comme la Chromatographie d&#39;échange d&#39;ions et une Chromatographie d&#39;exclusion de taille dépendent des propriétés physiques de la protéine cible, tels que son point isoélectrique et la charge ou de la taille, respectivement. Ces dernières caractéristiques de protéine sont partagées par une variété de protéines, ce qui augmente considérablement le risque de contamination de protéines dans des stratégies de purification de protéines classiques. Ce problème peut être contourné par l&#39;utilisation de plusieurs colonnes de purification, ce qui prend du temps. Dans le même temps, ces derniers exigent des méthodes de chromatographie montage expérimental coûteux. Affinity-tag purification augmente fortement cible spécificité, comme dans la plupart des cas, le tag sera unique à la protéine d&#39;intérêt. Dans des études récentes, la purification de drapeau ou HA-affinité a été largement utilisé. Contrairement à rec existanteprotocoles de purification de protéines ombinant dans les balises simples sont utilisés, nous avons établi la combinaison unique de deux balises. Notre procédé implique la fusion d&#39;une GST-tag à l&#39;extrémité N-terminale et une étiquette His à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine d&#39;intérêt, pour un rapport optimal entre la quantité et la pureté de la protéine souhaitée. La TPS est une longue étiquette (29 kDa), qui est très efficace pour la purification de glutathion billes de Sepharose. En outre, en utilisant la TPS garantit coût-efficacité de notre méthode 1. La possibilité de cliver la GST avec l&#39;enzyme PreScission (avec la séquence de reconnaissance LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, soit un ajout de seulement deux acides aminés) présente de nombreux avantages, par exemple, cette stratégie permet d&#39;éviter les altérations des fonctions des protéines physiologiques dus à encombrement allostérique. La petite étiquette His fusionnés à l&#39;autre extrémité sert de protéine dans une seconde étape de purification pour augmenter la pureté de la protéine par lavage hors de la TPS clivé, ainsi que les protéines dégradées et les autres<html> contaminants. En outre, le protocole ne nécessite pas d&#39;étape de dialyse lors du passage de la TPS à la colonne de l&#39;étape de purification His-(résine TALON). Contaminants communs dans ces procédés de purification sont Heat Shock Proteins (HSP). L&#39;ajout d&#39;une étape d&#39;incubation avec du MgCl 2 et de l&#39;ATP permet l&#39;élimination de ces contaminants (Figure 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) et chromatographie liquide haute performance (HPLC) sont des techniques courantes qui dépendent de l&#39;instrumentation coûteuse à produire un rendement élevé de la protéine purifiée d&#39;intérêt. Le protocole de purification en discontinu nous présentons ici, en revanche, est manuel et ne nécessite pas une installation coûteuse instrumental. Un rendement élevé de protéines peut être atteint par l&#39;intensification de la protocole. Dans le même temps, avec le protocole de purification en discontinu, le volume d&#39;élution peut être ajusté afin d&#39;augmenter la concentration en protéine, qui n&#39;est pas donné par FPLC ou HPLC. ntent &quot;&gt; En outre, avec la TPS-Son protocole de purification de lots, des protéines avec une gamme de taille de ~ 10-300 kDa peuvent être purifiés. Un des plus grands avantages est donnée par le fait que l&#39;on peut purifier plusieurs protéines en même temps , par exemple, à la fois de type sauvage et de sa protéine mutante. Le succès du protocole présenté dépend uniquement du niveau d&#39;expression et la solubilité de la protéine d&#39;intérêt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Dosages clés en enzymologie pour la caractérisation biochimique des protéines in vitro requièrent des concentrations élevées de la protéine purifiée d&#39;intérêt. protocoles de purification de protéines devraient combiner l&#39;efficacité, la simplicité et l&#39;efficacité des coûts 1. Ici, nous décrivons la TPS-Sa méthode comme un nouveau système de purification d&#39;affinité à petite échelle de protéines recombinantes, basée sur une marque N-terminal glutathion Sepharose (TPS) 2,3 et une étiquette de 10xHis C-terminal 4, qui sont tous deux fusionné pour la protéine d&#39;intérêt. Cette dernière construction est utilisée pour générer des baculovirus, par infection de cellules Sf9 infectées pour l&#39;expression des protéines 5. TPS est un peu long tag (29 kDa) qui sert à assurer l&#39;efficacité de la purification. Toutefois, il pourrait influencer les propriétés physiologiques de la protéine. Par conséquent, il est par la suite éliminé par clivage de la protéine en utilisant l&#39;enzyme PreScission 6. Afin d&#39;assurer une pureté maximale et d&#39;éliminer la TPS clivé, nousd&#39;ajouter une deuxième étape de purification par affinité sur la base de la relativement faible His-Tag. Surtout, notre technique est basée sur deux étiquettes différentes flanquant les deux extrémités de la protéine, qui est un outil efficace pour éliminer les protéines dégradées et, par conséquent, enrichit protéines pleine longueur. La méthode présentée ici ne nécessite pas une configuration instrumentale coûteux, comme FPLC. En outre, nous avons intégré MgCl2 et lavages ATP pour enlever les impuretés chaleur de protéines de choc et de traitement à la nucléase de supprimer les acides nucléiques contaminants. En résumé, la combinaison de deux étiquettes différentes flanquant la N-et C-terminal et la capacité de cliver une des balises, garantit la récupération d&#39;une protéine hautement purifiée et sur toute la longueur d&#39;intérêt.

Afin d&#39;illustrer l&#39;efficacité de la GST-His protocole de purification, nous avons purifié Rec14, un S. protéine de 32,9 kDa pombe. Le Rec14 ADNc a été cloné dans notre vecteur pFastBac1 modifiée permettant l&#39;ajout de la TPS et-ses-tags à la N-et C-terminales, respectivement (figure 1A). Baculovirus recombinants ont ensuite été préparés et utilisés pour infecter des cellules SF9 infectées pour l&#39;expression de la protéine. Les lysats cellulaires solubles on...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Dans le présent protocole, nous démontrons une méthode de purification de protéine hautement efficace et rentable à petite échelle, qui permet la purification de protéines recombinantes en combinant de manière unique un TPS-marqueur clivable et une petite étiquette His.

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