Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

אנו מודים אן מארי דיון-Cote לדיונים שהובילו לפיתוחה של השיטה. JK וRB הם חוקרים דוקטורט FQNRT, מ-MG הוא חוקר Vanier CIHR, וג&#39;-YM הוא חוקר בכיר FRSQ. עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר לJY. מ &#39;

1. ייצור רקומביננטי baculovirus Baculoviruses מופקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus Bac-to-Bac של Invitrogen בעיקר על פי הפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים בלבד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור pFastBac1 שונה (Gibco, חיים) נוצר המכיל GST ו תג?...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

GST-פרוטוקול הטיהור שהוצג כאן מתאים לטיהור של מגוון רחב של גדלים של חלבונים רקומביננטיים: אנחנו מטוהרים בהצלחה לי RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), וחלבון לא יציב משקל מולקולרי גבוה של infantum שושנת יריחו: Li-BRCA2 (125kDa) 6,9. יתר על כן, החלבונים מטוהרים עם פרוטוקול זה ה?...

הטיהור של חלבונים רקומביננטי היא חיונית כדי לענות על שאלות בסיסיות בביוכימיה. דרכים מקובלות של טיהור חלבונים כמו כרומטוגרפיה חילוף יונים והרחקת גודל כרומטוגרפיה להסתמך על תכונות פיסיקליות של חלבון המטרה, כגון נקודה איזואלקטרית ותשלום או גודל, בהתאמה. מאפייני החלבון האחרונים משותפים למגוון של חלבונים, אשר מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי לזיהום חלבונים באסטרטגיות טיהור חלבונים קונבנציונליות. בעיה זו עלולה לעקוף עם השימוש בעמודות טיהור מרובות, אשר זה זמן רב. במקביל, שיטות כרומטוגרפיה האחרונות דורשות התקנה ניסיונית יקרה. טיהור זיקת תג מגביר משמעותית יעד ספציפי, כמו ברוב המקרים התג יהיה ייחודי לחלבון של עניין. במחקרים שנערך לאחרונה, טיהור דגל או HA-זיקה כבר בשימוש נרחב. בניגוד לrec הקייםפרוטוקולי טיהור חלבוני ombinant הבמשמשים תגים בודדים, הקמנו את השילוב הייחודי של שני תגים. השיטה שלנו כרוכה ההיתוך של GST-תג בN-הסופית והתג שלו בC-הסופית של החלבון של עניין, ליחס אופטימלי בין הכמות וטוהר של החלבון הרצוי. GST הוא תג ארוך (29 KDA), שהוא יעיל ביותר לטיהור בחרוזי Sepharose גלוטתיון. יתר על כן, באמצעות GST מבטיח עלות אפקטיביות של שיטת 1 שלנו. האפשרות לבקע את GST עם אנזים PreScission (עם רצף הכרת LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, וכתוצאה מכך התוספת של רק שתי חומצות אמינו) יש יתרונות רבים, למשל, אסטרטגיה זו תמנע שינויים של פונקציות החלבון הפיזיולוגיות בשל הפרעה allosteric. התג שלו הקטן התמזגו הגפיים חלבון האחרים משמש בשלב טיהור שני כדי להגדיל את טוהר חלבון על ידי שטיפה את GST ביקע, כמו גם חלבונים ואחרים מושפלים<html> מזהמים. בנוסף, הפרוטוקול אינו מחייב צעד דיאליזה בעת מעבר מGST לעמודה שלו לטיהור צעד (שרף TALON). מזהמים נפוצים בתהליכי טיהור כאלה הם החלבונים Heat Shock (HSP). התוספת של שלב דגירה עם MgCl 2 ו-ATP מאפשרת הסרת המזהמים אלה (איור 1). חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) וביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) הן טכניקות נפוצות שתלויה במכשור יקר לייצר תשואה גבוהה של החלבון מטוהר של עניין. פרוטוקול הטיהור אצווה אנו מציגים כאן, לעומת זאת, הוא ידני ואינו דורש התקנת אינסטרומנטלי יקרה. ניתן להגיע לתשואה גבוהה של חלבון על ידי דרוג את הפרוטוקול. במקביל, עם פרוטוקול הטיהור אצווה, elution הנפח יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ריכוז חלבון, שאינו נתון עם FPLC או HPLC. ntent &quot;&gt; כמו כן, עם GST-פרוטוקול הטיהור אצווה, חלבונים עם גודל טווח של ~ 10-300 kDa יכולים להיות מטוהרים. אחד היתרונות הגדולים ביותר הוא שניתן על ידי העובדה שאחד יכול לטהר כמה חלבונים באותו הזמן , למשל, שניהם wild-type ו המוטציה בחלבון שלה. ההצלחה של הפרוטוקול המובא אך ורק תלוי ברמת הביטוי והמסיסות של החלבון של עניין.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

מבחני מפתח בהאינזימולוגיה לאפיון ביוכימי של חלבונים במבחנה מחייבים ריכוז גבוה של החלבונים המטוהרים של עניין. פרוטוקולי טיהור חלבון צריכים לשלב יעילות, פשטות ויעילות עלות 1. כאן, אנו מתארים את שיטת GST-כמערכת חדשה בקנה מידה קטן טיהור זיקה לחלבונים רקומביננטיים, המבוססת על תג N-מסוף גלוטתיון Sepharose (GST) 2,3 ותג 10xHis טרמינל C-4, אשר שניהם התמזגו לחלבון של עניין. המבנה השני משמש להפקת baculoviruses, לזיהום של תאים נגועים Sf9 לביטוי חלבון 5. GST הוא תג ארוך למדי (29 KDA) המשמש כדי להבטיח את יעילות טיהור. עם זאת, זה יכול להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של החלבון. לפיכך, הוא ביקע לאחר מכן את החלבון באמצעות אנזים PreScission 6. על מנת להבטיח את טוהר מרבי וכדי להסיר את GST ביקע, אנחנוהוסיף צעד טיהור הזיקה שני המבוסס על התג שלו קטן יחסית. חשוב מכך, הטכניקה שלנו מבוססת על שני תגים שונים איגוף שני קצוות של החלבון, אשר הוא כלי יעיל כדי להסיר חלבונים מושפלים, ולכן מעשיר את החלבונים באורך מלא. השיטה שהוצגה כאן אינה דורשת התקנת אינסטרומנטלי יקרה, כגון FPLC. בנוסף, אנו משולבים MgCl 2 ושוטף ATP כדי להסיר זיהומים חלבון הלם חום וטיפול nuclease לבטל לזהם חומצות גרעין. לסיכום, השילוב של שני תגים שונים איגוף N-וה-C-מסוף ואת היכולת לבקע את אחד מהתגים, ערבויות ההתאוששות של חלבון נקי במיוחד ואורך מלא של עניין.

כדי להמחיש את היעילות של GST-פרוטוקול הטיהור, אנחנו מטוהרים Rec14, ס חלבון pombe של 32.9 kDa. Rec14 cDNA שובט בוקטור pFastBac1 שונה שלנו ומאפשר תוספות של GST-ו תגים בN-ו-C-Termini, בהתאמה (איור 1 א). baculovirus רקומביננטי הוכן לאחר מכן ונהג להדביק תאים נגועים SF9 לביטוי חלבון. Lysates התא ...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...