Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
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我々は法の開発につながる議論アンヌ=マリー·ディオン·コートに感謝します。 JKとRBはFQNRT博士学者、M.-MGはバニエCIHR学者であり、J.-YMはFRSQ上級研究員である。この作品は、自然科学と工学研究評議会からJYへの資金によってサポートされていました。 M.

1。組換えバキュロウイルスの作製バキュロウイルスは、主に、わずかな修正を加えた製造業者のプロトコルに従って、Invitrogen社のBac-to-Bacバキュロウイルス発現系を用いて生成されます。 <ol><li>修正するpFastBac1ベクター（Gibco社、生命）は、GSTおよびHis-タグ（ 図2）を含む作成されました。をpET-52bの（+）ベクター（Novagen）のマルチクローニングサイト（MC...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

ここで紹介する、GST-Hisの精製プロトコルは、組換えタンパク質の大きさの広い範囲の精製に適している：我々は成功して李 RAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa）、および不安定な高分子量のタンパク質の精製リーシュマニア幼児 ： 李 BRCA2（125kDa）6,9。また、このプロトコルを使用して精製したタンパク質は、6生化学的に活性であった。この方法の...

組換えタンパク質の精製は、生化学の基本的な質問に対処することが重要である。イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ​​排除クロマトグラフィーのようなタンパク質精製の従来の方法は、それぞれ、例えば、その等電点、電荷またはサイズなどの標的タンパク質の物理的性質に依存する。後者のタンパク質特性が大幅に従来のタンパク質精製方法でタンパク質を汚染する可能性を増大させる種々のタンパク質が共有されています。この問題は、時間がかかり、複数の精製カラムの使用により回避することができる。同時に、後者のクロマトグラフィー法は、高価な実験装置を要求する。ほとんどの場合、タグは、目的のタンパク質に固有であるように、アフィニティータグ精製が強く、標的特異性を増加させる。最近の研究では、違反またはHA-アフィニティー精製が広く用いられている。 既存rec視聴とは対照的に単一のタグが使用されるombinantタンパク質精製プロトコルは、2つのタグのユニークな組み合わせを確立した。我々の方法は、所望のタンパク質の量と純度との間の最適な比率のために、目的のタンパク質のC末端にN-末端およびHisタグにおけるGST-タグの融合を含む。 GSTはグルタチオンセファロースビーズでの精製のための非常に効率的で、長いタグ（29 kDa）の、ある。さらに、GSTを使用すると、本手法1の費用対効果を保証します。 （わずか2つのアミノ酸の付加、その結果、認識配列LeuGluValLeuPheGln / GlyProで）プレシジョン酵素GSTを切断する可能性は多くの利点を有し、例えば、この戦略は、アロステリック障害のために、生理学的タンパク質の機能の変化を回避する。他のタンパク質に融合した小端Hisタグは、切断されたGSTを洗い流し、ならびにタンパク質および他の分解によるタンパク質の純度を高めるために第二の精製工程において機能する<html>汚染物質。彼の精製工程カラム（TALON樹脂）にGSTの切り替えとさらに、プロトコルは、透析工程を必要としない。このような精製プロセスにおける一般的な汚染物質は、熱ショックタンパク質（HSP）である。 MgCl 2およびATPとのインキュベーション工程の追加は、これらの汚染物質を除去する（ 図1）を可能にする。 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、関心対象の精製されたタンパク質を高収率で生成するために高価な器具類に依存する一般的な技術である。我々はここで紹介するバッチ精製プロトコールは、対照的に、手動で、高価な楽器のセットアップを必要としません。タンパク質の高収量は、プロトコルをスケールアップして行くことができます。これと同時に、バッチ精製プロトコルで、溶出体積はFPLCまたはHPLCで指定されていないタンパク質濃度を向上させるために調整することができる。 ntent &quot;&gt;また、バッ​​チGST-Hisの精製プロトコルで、〜10〜300 kDaの範囲のサイズを有するタンパク質を精製することができる。最大の利点の一つは、一つは、同時にいくつかのタンパク質を精製することができるという事実によって与えられる。例えば、野生型及びその変異タンパク質の両方が提示されたプロトコルの成功は、単独で目的のタンパク質の発現レベルおよび溶解度に依存する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

インビトロにおけるタンパク質の生化学的特徴付けのための酵素学における重要なアッセイは、関心対象の精製されたタンパク質の高濃度を必要とする。タンパク質精製プロトコルは、効率性、単純性、および費用対効果1を結合する必要があります。ここでは、N-末端グルタチオンセファロースタグ（GST）2,3両融合されるC-末端10xHisタグ4に基づいて、組換えタンパク質のための新たな小規模アフィニティー精製システムとしてGST-Hisの方法を記載目的のタンパク質に。後者の構築物は、タンパク質発現のために5感染したSf9細胞の感染のために、バキュロウイルスを生成するために使用される。 GSTは、浄化効率を確保するのに役立つかなり長いタグ（29 kDa）のである。しかしながら、タンパク質の生理学的特性に影響を与えるかもしれない。従って、それは、その後、プレシジョン酵素6を用いてタンパク質から切断される。最大の純度を保証し、切断されたGSTを除去するために、我々比較的小さいHisタグに基づいて、第二のアフィニティー精製工程を追加した。重要なことには、我々の技術が劣化したタンパク質を除去し、従って、完全長タンパク質を豊かにするための効率的なツールであるタンパク質の両端に隣接する2つの異なるタグに基づいている。ここで紹介する方法は、FPLC等の高価な楽器のセットアップを必要としない。さらに、我々は、夾雑核酸廃止する熱ショックタンパク質不純物およびヌクレアーゼ処理を除去するためにMgCl 2およびATPの洗浄を組み込んだ。要約すると、隣接する2つの異なるタグの組合せN-およびC-末端とタグのいずれかを切断する能力が、興味のある高度に精製された全長タンパク質の回収で評価する。

GST-Hisの精製プロトコールの効率を例証するために、我々はRec14、S.精製 32.9 kDaでpombeのタンパク質。 Rec14 cDNAは、N-およびC-末端GST-およびHis-タグの付加を可能にする我々の修飾するpFastBac1ベクターであった（ 図1A）にクローニングした。組換えバキュロウイルスを調製し、次いで、タンパク質発現のためにSF9に感染した細胞に感染させた。可溶性細胞溶解物をGSTビー?...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

本プロトコルでは、一意に切断可能なGST-タグおよび小Hisタグを組み合わせることにより組換えタンパク質の精製を可能にする非常に効率的で費用対効果の高い小規模タンパク質精製方法を実証する。

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

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Research

JoVE Journal

Biology

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Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

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