Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
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우리는 방법의 개발에 선도적 인 토론을위한 앤 마리 디온 - 코트 감사합니다. JK와 RB는 FQNRT 박사 학자이며, M.-MG는 바니 에르 CIHR 학자이며, J.-YM는 FRSQ 수석 연구원이다. 이 작품은 자연 과학 및 JY에 공학 연구 협의회에서 기금에 의해 지원되었다. M.

1. 재조합 배큘로 바이러스의 제조 배큘로 바이러스는 주로 단지 약간의 수정 제조자의 프로토콜에 따라 인비 트로겐의 바크 투 바크 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성된다 : <ol><li> 수정 pFastBac1 벡터 (기브, 수명은) GST와 그의 - 태그 (그림 2)를 포함 만들었습니다. PET-52B (+) 벡터 (노바 젠)의를 다중 사이트 (MCS)는 10xHis 태그를 포함, pFastBac1 - 패 혈성-...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

여기에 제시된 GST - 그의 정화 프로토콜은 재조합 단백질의 크기의 넓은 범위의 정화를 위해 적당하다 : 우리는 성공적으로 리 RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), 불안정한 고 분자량의 단백질을 정제 리 슈만 편모충의 infantum : 리튬 BRCA2 (125kDa) 6.9. 또한,이 프로토콜을 사용하여 정제 된 단백질은 6 생화학 적 활성했다. 이 방법의 성공은 전적으로 목적 단백질...

재조합 단백질의 정제는 생화학의 근본적인 문제를 해결하기 위해 매우 중요합니다. 이온 교환 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 단백질 정제의 통상적 인 방법은 각각 같은 그것의 등전점과 충전 또는 크기와 같은 표적 단백질의 물리적 특성에 의존한다. 후자 단백질 특성은 상당히 통상적 인 단백질 정제 전략 단백질 오염의 기회를 증가 단백질의 다양성에 의해 공유된다. 이 문제는 시간 소모적이다 체류 정화 컬럼의 사용으로 피할 수있다. 동시에, 후자의 크로마토 그래피 방법은 고가의 실험 구성을 요구한다. 대부분의 경우 태그가 관심의 단백질에 고유하므로 선호도 태그 정화가 강하게 대상 특이성을 증가시킨다. 최근 연구에서, 플래그 또는 HA-친화력 정화 널리 사용되어왔다. 기존 REC 대조적하나의 태그가 사용되는 ombinant 단백질 정제 프로토콜은, 우리는이 태그의 고유 한 조합을 설립. 우리의 방법은 양 원하는 단백질의 순도 사이의 최적의 비율에 대한 관심의 단백질의 C-말단의 N-말단과 그의 태그에서 GST-태그의 융합을 포함한다. GST는 글루타티온 세 파로스 구슬 정화에 매우 효율적이다 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 또한, GST를 사용하여 우리의 방법 1의 비용 효율성을 보장합니다. (두 아미노산의 첨가의 결과로 인식 서열 LeuGluValLeuPheGln / GlyPro 가진) PreScission 효소와 GST를 절단 할 수있는 가능성은 많은 장점을 가지고 예를 들어, 이러한 전략은 알로 스테 릭 장애물로 인해 생리적 단백질 기능의 변경을 방지한다. 다른 단백질 말단에 융합 작은 그의 태그는 벽개 GST를 씻어 내고,뿐만 아니라 분해 단백질 및 기타에 의해 단백질 순도를 증가시키기 위해 제 정제 공정에 제공<html> 오염 물질. 그의 정화 단계의 열 (TALON 수지)에 GST 전환 할 때 또한 프로토콜은 투석 단계가 필요하지 않습니다. 이러한 정제 과정에서 일반 오염 물질은 열 충격 단백질 (HSP)이다. MgCl2를 ATP와 함께 인큐베이션 단계의 첨가는 이러한 오염물을 제거 (도 1)을 허용한다. 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 관심의 정제 된 단백질의 높은 수율을 생성하기 위해 고가의 장비에 의존하는 일반적인 기술이다. 우리가 여기에 존재하는 배치 정화 프로토콜은, 대조적으로, 수동이며, 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 단백질의 높은 수율이 프로토콜을 확장하여 도달 할 수 있습니다. 동시에 일괄 정제 프로토콜, 용출 부피는 FPLC 또는 HPLC와 관련되지 않은 단백질의 농도를 향상시키기 위해 조정될 수있다. ntent &quot;&gt; 또, 일괄 GST-그의 정제 프로토콜 ~ 10-300 kDa의의 크기 범위를 가진 단백질을 정제 할 수있다. 큰 장점 중 하나는 하나가 동시에 여러 단백질을 정제 할 수 있다는 사실에 의해 주어진다 예를 들어, 야생형과 돌연변이 단백질 둘. 제시된 프로토콜의 성공은 전적으로 그 단백질의 발현 수준과 용해도에 의존한다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

체외에서 단백질의 생화학 적 특성에 대한 효소 학의 핵심 분석은 그 정제 된 단백질의 높은 농도를 필요로. 단백질 정제 프로토콜은 효율, 단순성 및 비용 효율성을 배합 한 것이다. 여기에서, 우리는 N-말단 글루타티온 세 파로스 태그 (GST) 2,3 모두 융합 C-말단 10xHis 태그 4를 기반으로 재조합 단백질에 대한 새로운 소규모의 친화력 정화 시스템으로 GST - 그의 방법을 설명 관심의 단백질. 후자의 구조는 단백질 발현을위한 5 인 Sf9 감염된 세포의 감염을 위해, 배큘로 바이러스를 생성하는데 사용된다. GST는 정화 효율을 보장하는 역할을 다소 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 그러나, 단백질의 생리 학적 성질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 후속 적으로 10 PreScission 효소를 사용하여 단백질을 분해한다. 최대 순도를 보장하고, 쪼개진 GST를 제거하기 위해 우리비교적 작은 그의 - 태그를 기반으로 두 번째 친 화성 정제 단계를 추가했습니다. 중요한 사실은, 우리의 기술이 따라서 저하 된 단백질을 제거하기위한 효과적인 도구이다 단백질의 양단 측면에 위치하고있는 두 개의 서로 다른 태그에 기초하고, 전장 단백질을 풍부. 여기에 제시된 방법은 FPLC 등 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 또한, 우리는 열 충격 단백질 불순물과 핵산을 오염 폐지하는 핵산 분해 효소 처리를 제거하는 MgCl2를하고 ATP 세척을 통합. 요약하면, 플 랭킹이 다른 태그의 조합을 N-및 C-말단 및 태그 중 하나를 절단하는 기능을, 또한 고순도 및 전장 단백질의 회수를 보증한다.

GST-그의 정제 프로토콜의 효율을 예시하기 위해, 우리는 Rec14, S. 정제 32.9 kDa의의의 pombe 단백질. Rec14 cDNA를 각각 N-및 C-말단 (그림 1A)에서 GST - 그의 - 태그의 추가를 허용하는 우리의 수정 pFastBac1 벡터에 클로닝 하였다. 재조합 배큘로 바이러스는 다음 제조 및 단백질 발현을 위해 감염된 SF9 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 수용성 세포 용 해물은 GST 비즈 배양과 결합...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

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