Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

Vi takker Anne-Marie Dion-Cote for diskusjoner som fører til utvikling av metoden. JK og RB er FQNRT stipendiater, er M.-MG en Vanier CIHR lærd, og J.-YM er et FRSQ seniorforsker. Dette arbeidet ble støttet av midler fra de naturvitenskapelige forskningsråd til JY. M.

En. Produksjon av rekombinant Baculovirus Baculovirus er generert ved hjelp av Bac-til-Bac Baculovirus Expression System of Invitrogen hovedsak i samsvar med produsentens protokoll med kun små endringer: <ol><li> En modifisert pFastBac1 vektor (Gibco, liv) ble opprettet som inneholder GST og Hans-tags (figur 2). Den MultiCloning Side (MCS) av en PET-52b (+) vektor (Novagen), som inneholder en 10xHis-tag, ble satt inn i MCS av en pFastBac1 vektor for å generere pFastBac1-...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

Den GST-Hans rensing protokoll som presenteres her er egnet for rensing av et bredt spekter av størrelser av rekombinante proteiner: Vi vellykket renset Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), og en ustabil høy molekylvekt protein av Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Videre er proteiner renset med denne protokollen var biokjemisk aktive 6. Suksessen med denne fremgangsmåten bare er avhengig av uttrykk, løselighet og stabilitet av det ønskede protein. </p...

Rensing av rekombinante proteiner er avgjørende for å løse grunnleggende spørsmål i biokjemi. Konvensjonelle måter for proteinrensing som ionebytterkromatografi og gelfiltrerings-kromatografi er avhengige av de fysiske egenskapene til målproteinet som sitt isoelektriske punkt og lade eller størrelse, henholdsvis. De sistnevnte protein karakteristika deles av en rekke proteiner, noe som øker betydelig sjansen for kontaminerende proteiner i konvensjonelle proteinrensestrategier. Dette problem kan omgås ved bruk av flere rensekolonner, noe som er tidkrevende. På samme tid, de sistnevnte kromatografiske metoder krever kost eksperimentelle oppsettet. Affinitet-tag rensing kraftig øker mål-spesifisiteten, som i de fleste tilfellene merkelappen vil være unik for proteinet av interesse. I nyere studier har Flagg-eller HA-affinitetsrensing blitt mye brukt. I motsetning til eksisterende recombinant protein rensing protokoller hvor enkle koder brukes, etablerte vi en unik kombinasjon av to koder. Vår metode involverer fusjon av en GST-tag ved N-terminus og en His-tag ved C-terminus av proteinet av interesse, for et optimalt forhold mellom mengde og renhet av det ønskede protein. GST er en lang kode (29 kDa), noe som er svært effektiv for rensing på glutation Sepharose-kuler. Videre bruker GST garanterer kostnadseffektivitet av vår metode en. Muligheten for å spalte av GST med PreScission enzymet (med gjenkjennelsessekvens LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, noe som resulterer i at tilsetningen av bare to aminosyrer) har mange fordeler, for eksempel, unngår denne strategien endringer i de fysiologiske proteinfunksjoner på grunn av allosterisk hindring. Den lille His-tag kondensert til den andre protein ekstremiteten tjener i et andre rensetrinn for å øke protein renhet ved vask av den avspaltede GST, samt degradert proteiner og annet<html> forurensninger. I tillegg gjør protokollen krever ikke en dialyse skritt når du bytter fra GST til Hans-rensingen kolonne (Talon harpiks). Vanlige forurensninger i slike renseprosessene er Heat Shock Proteins (HSP). Tilsetningen av et inkubasjonstrinn med MgCl2 og ATP tillater fjerning av disse forurensninger (fig. 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er vanlige teknikker som er avhengig av kostbar instrumentering for å gi høyt utbytte av det rensede protein av interesse. Den batch rensing protokollen vi presenterer her, i kontrast, er manuell og krever ikke en dyr instrumental oppsett. En høy avkastning av protein kan nås ved å skalere opp protokollen. På samme tid, og den satsvise rensing protokollen, elueringsvolumet kan justeres for å øke proteinkonsentrasjonen, som ikke er gitt med FPLC eller HPLC. ntent &quot;&gt; Også med batch GST-His rensing protokollen, proteiner med et størrelsesområde fra ~ 10 til 300 kDa kan renses. Ett av de største fordelene er gitt ved det faktum at man kan rense flere proteiner samtidig For eksempel, både et villtype og dets mutant protein. Suksessen til den fremlagte protokoll utelukkende avhenger av uttrykket nivå, og løseligheten av proteinet av interesse.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Nøkkel assays in Enzymology for biokjemisk karakterisering av proteiner in vitro nødvendiggjør høye konsentrasjoner av det rensede protein av interesse. Protein rensing protokoller bør kombinere effektivitet, enkelhet og kostnadseffektivitet en. Her beskriver vi GST-Hans metode som en ny småskala affinitetsrensing system for rekombinante proteiner, basert på en N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) 2,3 og en C-terminal 10xHis tag 4, som begge er smeltet til proteinet av interesse. Den sistnevnte konstruksjon blir brukt til å generere baculovirus, for infeksjon i Sf9-infiserte celler for proteinekspresjon 5. GST er en ganske lang-tagg (29 kDa) som tjener til å sikre at renseeffekt. Imidlertid kan det påvirke fysiologiske egenskaper av proteinet. Derfor er det deretter spaltes av proteinet ved hjelp av PreScission enzymet 6.. For å sikre maksimal renhet og for å fjerne det avspaltede GST, vilagt til en andre affinitetsrensing trinn basert på den forholdsvis lille His-Tag. Viktigere er vårt teknikk basert på to forskjellige koder som flankerer de to endene av protein, som er et effektivt verktøy for å fjerne nedbrutte proteiner og derfor beriker full-lengde proteiner. Metoden som presenteres her ikke krever en kostbar instrumental oppsett, for eksempel FPLC. I tillegg er innarbeidet vi MgCl2 og ATP vaskinger for å fjerne varme-sjokk protein urenheter og nuklease-behandling for å oppheve forurensende nukleinsyrer. I sammendrag, er kombinasjonen av to forskjellige koder som flankerer den N-og C-terminale, og evnen til å holde seg ved en av de kodene, garanterer utvinning av et høyt renset, og full-lengde proteinet av interesse.

For å illustrere effektiviteten av GST-His rensing protokollen, renset vi Rec14, en S. pombe protein av 32,9 kDa. Den Rec14 cDNA ble klonet i vår endret pFastBac1 vektor slik at tilleggene av GST-og Hans-tags på N-og C-termini, henholdsvis (figur 1A). Rekombinante baculovirus ble deretter fremstilt og brukt til å infisere Sf9-infiserte celler for proteinekspresjon. De oppløselige cellelysater ble inkubert med GST-perler og bundet-proteiner ble eluert ved å spalte den med GST PreScission p...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

I den foreliggende protokoll, vi demonstrere en svært effektiv og kostnadseffektiv småskala protein rensing metoden, som gjør det mulig for rensing av rekombinante proteiner ved unikt å kombinere en cleavable GST-tag og en liten Hans-tag.

GST-Hans rensing: en to-trinns Affinitetsrensing Protocol Givende Full-lengde Purified Proteiner

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiske Rensing av Highly Active gjær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonale Protein Purification Tilrettelagt av en Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifisering av protein komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Med sekvensiell Peptide affinitetsrensing i kombinasjon med tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Rensing av Affinity-merket rekombinante proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Rensing-fri metode for Binding Affinity Fastsettelse av mikroskala Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifisere Protein-protein samhandling i<em&gt; Drosophila</em&gt; Voksen Heads av Tandem Affinitetsrensing (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...