Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
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Agradecemos a Anne-Marie Dion-Cote para discussões que levaram ao desenvolvimento do método. JK e RB são FQNRT estudiosos de doutorado, M.-MG é um estudioso Vanier CIHR e J.-YM é pesquisador sênior FRSQ. Este trabalho foi apoiado por fundos de Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia de JY. M.

1. Produção de recombinante de baculovírus Os baculovírus são gerados utilizando o Sistema de Expressão de Baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen, principalmente de acordo com o protocolo do fabricante, com apenas ligeiras modificações: <ol><li> Um vetor pFastBac1 modificado (Gibco, a vida) foi criado contendo o GST e Seus-tags (Figura 2). O local de clonagem múltipla (MCS) de pET-52b (+) vector (Novagen), que contém uma etiqueta 10xHis, foi inserido no mcs de um v...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

A GST-His protocolo de purificação aqui apresentada é adequada para a purificação de uma ampla gama de tamanhos de proteínas recombinantes: Foram purificados com sucesso Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), e um alto teor de proteína de peso molecular de instável Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Além disso, as proteínas purificadas com este protocolo foram bioquimicamente ativo 6. O sucesso deste método depende unicamente da expressão, solubil...

A purificação de proteínas recombinantes é crucial para tratar de questões fundamentais em bioquímica. As formas convencionais de purificação de proteínas, como a cromatografia de permuta iónica e cromatografia de exclusão de tamanho dependem de propriedades físicas da proteína-alvo, tais como o seu ponto isoeléctrico e carga ou tamanho, respectivamente. As características da proteína últimos são partilhados por uma variedade de proteínas, o que aumenta consideravelmente a probabilidade de as proteínas contaminantes, em estratégias de purificação de proteínas convencionais. Este problema pode ser contornado com o uso de várias colunas de purificação, o que é demorado. Ao mesmo tempo, os últimos métodos de cromatografia de exigir configuração experimental caro. A purificação por afinidade-tag aumenta fortemente a especificidade do alvo, tal como na maioria dos casos, a marcação será único para a proteína de interesse. Em estudos recentes, com Flag ou HA-purificação de afinidade tem sido amplamente usado. Em contraste com rec existenteprotocolos de purificação de proteínas ombinant em que tags simples são utilizados, foi estabelecida a combinação única de duas tags. O nosso método envolve a fusão de uma etiqueta de GST na extremidade N-terminal e uma cauda de His no terminal C da proteína de interesse, para uma óptima relação entre a quantidade e pureza da proteína desejada. A GST é uma marca longa (29 kDa), que é altamente eficiente para a purificação sobre Sepharose de glutationa. Além disso, utilizando GST garante boa relação custo-eficácia de nosso método 1. A possibilidade de se clivar a GST com o enzima PreScission (com a sequência de reconhecimento LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, resultando na adição de apenas dois aminoácidos) tem muitas vantagens, por exemplo, esta estratégia evita a alteração das funções fisiológicas de proteínas devido a impedimento alostérico. O pequeno His-tag fundido com o outro extremo da proteína serve num segundo passo de purificação para aumentar a pureza da proteína por lavando a GST clivada, bem como proteínas degradadas e outros<html> contaminantes. Além disso, o protocolo não requer um passo de diálise quando se muda de GST para a coluna passo His-purificação (resina TALON). Contaminantes comuns em tais processos de purificação são proteínas de choque térmico (HSP). A adição de um passo de incubação com MgCl2 e ATP permite a remoção desses contaminantes (Figura 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) são técnicas comuns que dependem instrumentação dispendiosa para gerar um rendimento elevado de proteína purificada de interesse. O protocolo de purificação de lote apresentamos aqui, em contraste, é manual e não necessita de uma instalação instrumental caro. Um rendimento elevado de proteína pode ser alcançado com a expansão do protocolo. Ao mesmo tempo, com o protocolo de purificação do lote, o volume de eluição pode ser ajustada, a fim de aumentar a concentração de proteína, o que não é dada com FPLC ou HPLC. ntent &quot;&gt; Além disso, com a GST-His protocolo de purificação do lote, proteínas com uma gama de dimensões de ~ 10-300 kDa pode ser purificada. Uma das maiores vantagens é dada pelo facto de que se pode purificar várias proteínas ao mesmo tempo , por exemplo, tanto um de tipo selvagem e a sua proteína mutante. O sucesso do protocolo apresentado apenas depende do nível de expressão e a solubilidade da proteína de interesse.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Ensaios de chave em enzimologia para a caracterização bioquímica de proteínas in vitro, necessitam de elevadas concentrações de proteína purificada de interesse. Protocolos de purificação de proteína deve combinar eficiência, simplicidade e eficácia de custo 1. Aqui, nós descrevemos a GST-His método como um novo sistema de purificação por afinidade em pequena escala para as proteínas recombinantes, com base em um N-terminal de etiqueta de glutationa-Sepharose (GST) de 2,3 e uma marcação 10xHis C-terminal de 4, que são ambos fundida para a proteína de interesse. A última construção é usado para gerar baculovírus, para a infecção de células Sf9 infectadas para a expressão da proteína 5. GST é uma marca bastante longo (29 kDa), que serve para garantir a eficiência da purificação. No entanto, pode influenciar as propriedades fisiológicas da proteína. Por isso, é subsequentemente clivado da proteína usando a enzima PreScission 6. A fim de assegurar a máxima pureza e para remover a GST clivada, nósadicionou-se uma segunda etapa de purificação por afinidade com base na comparativamente pequena de His. Mais importante, a nossa técnica é baseada em duas etiquetas diferentes flanqueiam as duas extremidades da proteína, que é uma ferramenta eficaz para remover as proteínas degradadas e, portanto, enriquece proteínas de comprimento total. O método aqui apresentado não requer uma configuração instrumental caros, tais como FPLC. Além disso, incorporamos MgCl2 e lavagens de ATP para remover impurezas da proteína de choque térmico e tratamento nuclease abolir contaminando ácidos nucléicos. Em resumo, a combinação de duas marcas diferentes flanqueiam o N-e C-terminal e a capacidade para clivar um dos marcadores, garante a recuperação de uma proteína altamente purificada e de comprimento completo de interesse.

A fim de ilustrar a eficácia da GST-His protocolo de purificação, que purificado Rec14, um S. pombe proteína de 32,9 kDa. O Rec14 cDNA foi clonada no nosso vector pFastBac1 modificado permitindo a adição de GST-e Seus-tags no N-e C-terminais, respectivamente, (Figura 1A). Baculovírus recombinantes foram então preparados e utilizados para infectar células SF9 infectadas para a expressão da proteína. Os lisados ​​celulares solúveis foram incubados com contas de GST e proteínas li...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

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