Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

Мы благодарим Анн-Мари Dion-Côte для обсуждений, в развитии метода. JK и РБ являются FQNRT докторские ученые, М.-MG является ученым Ванье CIHR, Дж.-YM является старший научный сотрудник FRSQ. Эта работа была поддержана за счет средств естественных наук и инженерного исследовательского совета в JY. М.

1. Производство рекомбинантного бакуловируса Бакуловирусы генерируются с использованием Бакуловирусные Expression System Бак-в-Баке из Invitrogen в основном в соответствии с протоколом производителя с только незначительными изменениями: <ol><li> Модифицированная pFastBac1 вектор (Гибко...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

GST-Его очистка протокол, представленные здесь, пригодны для очистки в широком диапазоне размеров рекомбинантных белков: Мы успешно очищен Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) и нестабильную высокой молекулярной массой белок Лейшмания infantum: Ли BRCA2 (125kDa) 6,9. Кроме того, белки, очищен...

Очистку рекомбинантных белков имеет решающее значение для решения фундаментальных вопросов биохимии. Обычные способы очистки белка, такие как ионообменной хроматографии и гель-проникающей хроматографии полагаться на физические свойства белка-мишени, такие как его изоэлектрической точке и заряда или размера, соответственно. Последние характеристики белка являются общими для различных белков, что значительно повышает шансы на примесные белки в обычных стратегий очистки белков. Эта проблема может быть преодолена с использованием нескольких столбцов очистки, которая отнимает много времени. В то же время, последние методы хроматографии требуют дорогой экспериментальную установку. Очистка Affinity-тег сильно возрастает целевой специфичностью, как и в большинстве случаев метка будет уникальным для интересующего белка. В недавних исследованиях, Флаг-или HA-аффинной очистки широко используется. В отличие от существующих рекombinant протоколы очистки белков, в которых используются одиночные теги, мы создали уникальную комбинацию двух тегов. Наш метод предполагает слияние с GST-тега на N-конце и His-тэга на С-конце белка интереса, для оптимального соотношения между количеством и чистотой целевого белка. GST длинный тег (29 кДа), который является высокоэффективным для очистки на гранулах сефарозы глутатиона. Кроме того, с помощью GST гарантирует экономическую эффективность нашего метода 1. Возможность для расщепления от GST с ферментом PreScission (с последовательность узнавания LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, в результате добавления всего двух аминокислот) имеет много преимуществ, например, эта стратегия позволяет избежать изменения физиологических функций белка из-за аллостерической помех. Небольшой His-метка, слитый с другим белком конечности служит в качестве второго шага очистки увеличить чистоту белка путем смывания расщепленный GST, а также деградируют белки и другие<html> загрязняющие вещества. Кроме того, протокол не требует стадии диализа при переключении из GST с His-стадии очистки колонку (TALON смолы). Общие загрязняющих веществ в таких процессах очистки являются Белки теплового шока (HSP). Добавление инкубационного ногу с MgCl 2 и АТФ допускает удаление этих загрязнений (рис. 1). Быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) общие методы, которые зависят от дорогих приборов для генерации высокий выход очищенного белка. Очистка протокола пакетного мы представляем здесь, в отличие, является ручной и не требует дорогостоящего инструментального установки. Высокий выход белка может быть достигнуто путем расширения протокола. В то же время, с протоколом пакетной очистки, объем элюирования можно регулировать с целью повышения концентрации белка, который не дано с FPLC или ВЭЖХ. ntent &quot;&gt; Кроме того, с GST-Его протокол очистки пакетного белки с размером-диапазоне ~ 10-300 кДа может быть очищен. Одна из самых больших преимуществ задается на то, что можно очистить несколько белков в то же время Например, как дикого типа и его мутантный белок. Успех представленной протокола зависит исключительно от уровня экспрессии и растворимости белка, представляющего интерес.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Основные анализы в энзимологии для биохимического характеризации белков в пробирке требуют высоких концентраций очищенного белка, представляющего интерес. Протоколы очистки белков должен сочетать в себе эффективность, простоту и эффективность затрат 1. Здесь мы опишем GST-его метод в качестве нового малого аффинной очистки системы рекомбинантных белков, основанный на N-концевой глутатион Сефарозе Tag (GST) 2,3 и С-концевые 10xHis метки 4, которые оба плавленого к белку интерес. Последний конструкция используется для генерации бакуловирусов, для заражения инфицированных клеток Sf9 для экспрессии белка 5. НДС является довольно долго тег (29 кДа), который служит для обеспечения эффективности очистки. Тем не менее, это может влиять на физиологические свойства белка. Таким образом, он впоследствии отщепляется белка с использованием фермента предразрывных 6. Для того, чтобы обеспечить максимальную чистоту и снять расщепленный GST, мыдобавили вторую стадию очистки на основе сродства сравнительно небольшой His-Tag. Важно отметить, что наша методика основана на двух различных меток, фланкирующих два конца белка, который является эффективным средством для удаления деградированных белков и, следовательно, обогащает полноразмерные белки. Метод, представленный здесь, не требует дорогостоящего инструментального настройки, такие как FPLC. Кроме того, мы включили MgCl 2 и АТФ вымывания белка теплового шока примесей и нуклеазы лечение отменить загрязняющих нуклеиновых кислот. Таким образом, сочетание двух разных тегов фланговые N-и С-концевой и способность расщеплять от одного из тегов, гарантирует восстановление с высокой степенью чистоты и полноразмерного белка интереса.

Для того чтобы проиллюстрировать эффективность GST-Его протокол очистки, мы очистили Rec14, в С. ротЬе белок 32,9 кДа. Rec14 кДНК клонировали в нашей модифицированной pFastBac1 вектора позволяя добавки GST-и ГИС-тегов в то N-и C-концов, соответственно (рис. 1А). Рекомбинантный бакуловирус З?...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

В настоящем протоколе, мы демонстрируем высокоэффективную и экономичную мелкого способа очистки белка, что позволяет очистку рекомбинантных белков однозначно объединения расщепляемую GST-тег и небольшой His-тег.

GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Очистка Hsp104, белка Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Хроматографической очистки высокоактивной рибосомы дрожжей

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Определение белок-белковых взаимодействие в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Взрослые Главы по Tandem аффинной очистки (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...