Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
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Damos las gracias a Anne-Marie Dion-Cote para los debates que conducen al desarrollo del método. JK y RB son FQNRT académicos de doctorado, M.-MG es un erudito Vanier CIHR, y J.-YM es un investigador senior FRSQ. Este trabajo fue apoyado por fondos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de JY. M.

1. Producción de baculovirus recombinante Los baculovirus son generados utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen principalmente de acuerdo con el protocolo del fabricante con modificaciones sólo leves: <ol><li> A pFastBac1 vector modificado (Gibco, la vida) fue creado que contiene el GST y Sus etiquetas (Figura 2). El sitio de clonación múltiple (MCS) de un pET-52b (+) vector (Novagen), que contiene una 10xHis-tag, se insertó en el M...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

El GST-Su protocolo de purificación que aquí se presenta es adecuado para la purificación de una amplia gama de tamaños de proteínas recombinantes: Se purificaron con éxito Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130kDa), y una proteína de alto peso molecular inestable peso de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Por otra parte, las proteínas purificadas con este protocolo eran bioquímicamente activa 6. El éxito de este método depende únicamente de la expres...

La purificación de proteínas recombinantes es crucial para hacer frente a cuestiones fundamentales de la bioquímica. Formas convencionales de purificación de proteínas, como la cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaños se basan en las propiedades físicas de la proteína diana, como su punto isoeléctrico y la carga o el tamaño, respectivamente. Las características de proteínas últimos son compartidos por una variedad de proteínas, lo que aumenta considerablemente la probabilidad de proteínas contaminantes en las estrategias de purificación de proteínas convencionales. Este problema puede ser evitado con el uso de múltiples columnas de purificación, lo que consume tiempo. Al mismo tiempo, los métodos de cromatografía de éstos exigen configuración experimental caro. La purificación por afinidad-etiqueta aumenta fuertemente objetivo-especificidad, como en la mayoría de los casos la etiqueta será único para la proteína de interés. En estudios recientes, la purificación de la bandera-o HA-afinidad se ha usado ampliamente. En contraste con rec existenteprotocolos de purificación de proteínas ombinant en la que se utilizan etiquetas individuales, se estableció la combinación única de dos etiquetas. Nuestro método implica la fusión de una etiqueta de GST en el extremo N-terminal y una etiqueta de His en el extremo C-terminal de la proteína de interés, para una relación óptima entre la cantidad y la pureza de la proteína deseada. El GST es un largo etiqueta (29 kDa), que es altamente eficiente para la purificación sobre glutatión Sepharose bolas. Por otra parte, el uso de GST garantiza la rentabilidad de nuestro método 1. La posibilidad de escindir la GST con la enzima PreScission (con secuencia de reconocimiento de LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, lo que resulta en la adición de sólo dos aminoácidos) tiene muchas ventajas, por ejemplo, esta estrategia evita alteraciones de las funciones de las proteínas fisiológicas debido al impedimento alostérico. La pequeña etiqueta de His fusionada a la otra extremidad de proteína sirve en una segunda etapa de purificación para aumentar la pureza de proteína mediante el lavado de la GST escindido, así como las proteínas degradadas y otra<html> contaminantes. Además, el protocolo no requiere una etapa de diálisis cuando se cambia de la GST para columnas de paso de la Su-purificación (resina TALON). Contaminantes comunes en este tipo de procesos de purificación son proteínas de choque térmico (HSP). La adición de una etapa de incubación con MgCl 2 y ATP permite la eliminación de estos contaminantes (Figura 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son técnicas comunes que dependen de instrumentación costosa de generar un alto rendimiento de la proteína purificada de interés. El protocolo de purificación de lotes se presenta aquí, en contraste, es manual y no requiere una configuración de instrumento caro. Un alto rendimiento de proteína se puede llegar por la ampliación del protocolo. Al mismo tiempo, con el protocolo de purificación de lotes, el volumen de elución se puede ajustar con el fin de mejorar la concentración de proteína, que no se da con FPLC o HPLC. ntent &quot;&gt; También, con el GST-Su protocolo de purificación por lotes, las proteínas con un tamaño de rango de ~ 10-300 kDa pueden purificarse. Una de las mayores ventajas es dada por el hecho de que uno puede purificar varias proteínas al mismo tiempo , por ejemplo, tanto una de tipo salvaje y su proteína mutante. El éxito del protocolo presentado depende únicamente en el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína de interés.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Ensayos de clave en enzimología para la caracterización bioquímica de las proteínas in vitro requieren altas concentraciones de la proteína purificada de interés. Protocolos de purificación de proteínas deben combinar eficiencia, simplicidad y rentabilidad 1. Aquí, describimos la GST-Su método como un nuevo sistema de purificación por afinidad a pequeña escala para proteínas recombinantes, sobre la base de un N-terminal de la etiqueta glutatión Sepharose (GST) 2,3 y una etiqueta 10xHis C-terminal 4, que tanto se fusionan a la proteína de interés. La última construcción se utiliza para generar baculovirus, para la infección de las células Sf9 infectadas para la expresión de proteínas 5. GST es una etiqueta bastante largo (29 kDa), que sirve para asegurar la eficacia de la purificación. Sin embargo, podría influir en las propiedades fisiológicas de la proteína. Por lo tanto, en que posteriormente se escinde la proteína usando la enzima PreScission 6. Con el fin de garantizar la máxima pureza y para eliminar el GST escindido, nosañadido una segunda etapa de purificación de afinidad basada en la comparativamente pequeña etiqueta de His. Es importante destacar que, nuestra técnica se basa en dos etiquetas diferentes que flanquean los dos extremos de la proteína, que es una herramienta eficaz para eliminar las proteínas degradadas y, por lo tanto, enriquece proteínas de longitud completa. El método que aquí se presenta no requiere una configuración fundamental caros, tales como FPLC. Además, incorporamos MgCl 2 y lavados ATP para eliminar las impurezas de la proteína de choque de calor y tratamiento con nucleasa de abolir ácidos nucleicos contaminantes. En resumen, la combinación de dos etiquetas diferentes que flanquean el N-y C-terminal y la capacidad de escindir una de las etiquetas, garantiza la recuperación de una proteína altamente purificada y de longitud completa de interés.

Con el fin de ilustrar la eficiencia de la GST-Su protocolo de purificación, purificamos Rec14, un S. pombe proteína de 32,9 kDa. El cDNA fue clonado Rec14 en nuestro vector pFastBac1 modificado que permite la adición de GST-y sus etiquetas en el extremo N-y C-terminales, respectivamente (Figura 1 A). El baculovirus recombinante se prepararon entonces y se utilizan para infectar células SF9 infectadas para la expresión de proteínas. Los lisados ​​celulares solubles se incubaron con pe...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His.

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