Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

Vi tackar Anne-Marie Dion-Cote för överläggningar som leder till utvecklingen av metoden. JK och RB är FQNRT doktors forskare, är M.-MG en Vanier CIHR lärd, och J.-YM är en FRSQ senior forskare. Detta arbete stöddes av medel från naturvetenskap och teknik Forskningsrådet till JY. M.

1. Produktion av rekombinant baculovirus Baculoviruses genereras med hjälp av Bac-to-Bac baculovirusexpressionssystem av Invitrogen huvudsakligen i enlighet med tillverkarens protokoll med endast smärre ändringar: <ol><li> En modifierad pFastBac1 vektor (Gibco, liv) skapades innehållande GST-och His-taggar (Figur 2). Multikloningsstället (MCS) i en pET-52b (+)-vektorn (Novagen) innehållande en 10xHis tagg, sattes in i MCS i en pFastBac1 vektor för att generera pFast...

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

GST-His reningsprotokoll som presenteras här är lämplig för rening av ett brett urval av storlekar av rekombinanta proteiner: Vi renade framgångsrikt Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa) PALB2 (130kDa) och en instabil högmolekylärt protein av Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Dessutom är de proteiner som renats med detta protokoll var biokemiskt aktiv 6. Framgången med denna metod beror enbart på uttryck, stabilitet och löslighet av det önskade proteinet. <...

Reningen av rekombinanta proteiner är avgörande för att ta itu med grundläggande frågor i biokemi. Konventionella metoder för proteinrening såsom jonbyteskromatografi och gelkromatografi förlita sig på fysikaliska egenskaper hos målproteinet såsom dess isoelektriska punkt och laddning eller storlek, respektive. De senare proteinsärdrag delas av en mängd proteiner, vilket avsevärt ökar risken för kontaminerande proteiner i konventionella strategier för proteinrening. Detta problem kan kringgås med användning av flera reningskolonner, vilket är tidskrävande. Samtidigt, de senare kromatografiska metoder kräver dyra experimentuppställning. Affinity-tag rening ökar starkt mål-specificitet, som i de flesta fall taggen kommer att vara unik för proteinet av intresse. I senare studier har Flag-eller HA-affinitetsrening i stor utsträckning. I motsats till existerande recombinant proteinreningsprotokoll där enstaka taggar används, har vi etablerat en unik kombination av två taggar. Vår metod innebär fusion av en GST-markör vid N-terminalen och en His-tag vid C-änden av proteinet av intresse, för ett optimalt förhållande mellan kvantitet och renhet av det önskade proteinet. GST är en lång tagg (29 kDa), som är mycket effektiv för rening på glutation-Sepharose-pärlor. Dessutom, med hjälp av GST garanterar kostnadseffektivitet för vår metod 1. Möjligheten att klyva bort GST med PreScission enzym (med igenkänningssekvensen LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, vilket resulterar i tillsatsen av endast två aminosyror) har många fördelar, till exempel, undviker denna strategi förändringar av de fysiologiska proteinet fungerar på grund av allosterisk hinder. Den lilla His-tag fuserat till det andra proteinet extremitet tjänar i ett andra reningssteg för att öka proteinrenhet genom att tvätta bort det kluvna GST, samt nedbryts proteiner och andra<html> föroreningar. Dessutom ger protokollet inte kräver dialyssteg vid byte från GST till His-reningssteget kolonn (TALON harts). Vanliga föroreningar i sådana reningsprocesser är värmechockproteiner (HSP). Tillsatsen av ett inkubationssteg med MgCl2 och ATP tillåter avlägsnandet av dessa kontaminanter (figur 1). Snabb Protein Liquid Chromatography (FPLC) och högupplösande vätskekromatografi (HPLC) är vanliga tekniker som är beroende av dyra instrument för att generera högt utbyte av det renade proteinet av intresse. Satsreningsprotokoll som vi presenterar här, däremot, är manuell och inte kräver en dyr instrument-setup. Ett högt utbyte av protein kan uppnås genom ökning av protokollet. Samtidigt, med satsreningsprotokollet, elueringsvolymen kan justeras för att öka proteinkoncentrationen, som inte ges med FPLC eller HPLC. ntent &quot;&gt; Även med den sats GST-His reningsprotokoll, proteiner med ett storleksintervall av ca 10 till 300 kDa kan renas. En av de största fördelarna fås genom det faktum att en kan rena flera proteiner samtidigt , till exempel, både en vild typ och dess mutant protein. Framgången för den presenterade protokollet beror enbart på expressionsnivån och löslighet av proteinet av intresse.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Coli DH10Bac (competent)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Solution I and II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Bluo-Gal</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15519028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15529019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 infected cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission enzyme</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s infected medium supplemented</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>11605-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose resin</td>
			<td>GE bioscience</td>
			<td>17075605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon resin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>635504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>288324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco (Life)</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal GST-antibody</td>
			<td>Production in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 6X-His-antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (tight)</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (50 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2115217</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Viktiga analyser in Enzymology för biokemisk karakterisering av proteiner in vitro kräver höga koncentrationer av det renade proteinet av intresse. Proteinreningsprotokoll bör kombinera effektivitet, enkelhet och kostnadseffektivitet 1. Här beskriver vi GST-His-metoden som en ny småskalig affinitets reningssystem för rekombinanta proteiner, som bygger på en N-terminal glutation Sepharose-Tag (GST) 2,3 och en C-terminal 10xHis etiketten 4, som båda är sammansmält till proteinet av intresse. Den senare konstruktionen används för att generera baculovirus, för infektion av Sf9-infekterade celler för proteinexpression 5. GST är ett ganska långt tag (29 kDa) som tjänar till att säkerställa effektivitet rening. Däremot kan det påverka fysiologiska egenskaperna hos proteinet. Följaktligen är det därefter avspjälkas proteinet med användning av PreScission enzymet 6. För att säkerställa maximal renhet och för att avlägsna den kluvna GST, visattes ett andra affinitetsreningssteg baserat på den jämförelsevis lilla His-Tag. Viktigt är vår teknik baserad på två olika taggar som flankerar de två ändarna av det protein, vilket är ett effektivt verktyg för att ta bort nedbrutna proteiner och därmed berikar fullängdsproteiner. Den metod som presenteras här inte kräver en dyr instrumentella inställning, t.ex. FPLC. Dessutom införlivade vi MgCl2 och ATP-tvättar för att avlägsna värmechockprotein föroreningar och nukleasbehandling att avskaffa förorenande nukleinsyror. I sammanfattning, en kombination av två olika taggar flankerande N-och den C-terminala och förmåga att klyva bort en av taggarna, garantier återvinning av en högrenad och fullängds-proteinet av intresse.

I syfte att illustrera effektiviteten av GST-His reningsprotokoll, renades vi Rec14, en S. pombe protein på 32,9 kDa. Den Rec14 cDNA klonades i vår modifierade pFastBac1 vektor tillåter tillägg av GST-och His-taggar på N-och C-terminalerna, respektive (Figur 1A). Rekombinanta baculovirus ställdes sedan och användes för att infektera SF9 infekterade celler för proteinuttryck. De lösliga cellysat inkuberades med GST pärlor och bundna proteiner eluerades genom klyvning av GST med PreSci...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

I det nuvarande protokollet, visar vi en mycket effektiv och kostnadseffektiv småskalig proteinreningsmetod, som möjliggör rening av rekombinanta proteiner genom en unik kombination en klyvningsbar GST-tagg och en liten His-tag.

GST-Hans rening: En två-stegs Affinity Purification protokoll Flytfullängds renade proteiner

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Rening av Hsp104, ett protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonal proteinrening underlättas av en liten Bispecific Affinity Tagg

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifiera protein-proteininteraktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Vuxen Heads av Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...