Name: the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Y. Sasai pour avoir généreusement fourni l&#39;anticorps FOXG1. Ce travail a été soutenu par des subventions souches Connecticut recherche sur les cellules (08-SCB-UCHC- 022 et 11-SCB24) et la Fondation paraplégie spastique.

1. Génération des agrégats cellules souches pluripotentes humaines (D1 à D4) <ol><li> Cellules souches pluripotentes humaines sont mises en culture sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) alimentateurs en présence d&#39;un milieu additionné de CSEh facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF, 4 ng / ml). Après 5-7 jours de culture, lorsque les colonies sont grandes, mais encore indifférencié, ils sont prêts pour la prochaine étape. </li><li> La solution enzymatique doit d&#39;abord être...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells.">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li><li>Lee, H., Shamy, G. 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Res. 55, 223-233 (2006).</li><li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li><li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Pankratz, M. T., Li, X. 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Il ya plusieurs étapes importantes au cours du processus de différenciation neurale. Il est important de s&#39;assurer que les CSP sont pluripotentes humaines car, sinon, les cellules peuvent déjà être biaisée en vue de devenir une lignée non neuronales. Cela peut être confirmé par coloration des CSP de l&#39;homme avec des anticorps contre les marqueurs de pluripotence comme Oct4, Sox2, Nanog, et Tra-1-60 1-3. Si les guichets de l&#39;homme n&#39;attache pas très bien après les passages, inhibiteu...

Les cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (CISP), ont la capacité de produire tous les types de cellules dans le corps, y compris les neurones 1-3. Différenciation dirigée des différents sous-types neuronaux du PSC de l&#39;homme détient la clé de l&#39;application de ces cellules en médecine régénérative. La génération des sous-types neuronaux fonctionnels au cours du développement est un processus complexe impliquant l&#39;induction de la lignée neuronale, la spécification des progéniteurs régionales le long de l&#39;axe rostro-caudal, et la différenciation des types de neurones post-mitotiques des progéniteurs régionaux 4,5. A partir de 2001, plusieurs systèmes ont été mis en place pour générer des lignées de CSEh neurones, qui ont fourni une plate-forme pour la génération suivante de sous-types neuronaux 6,7. Basé sur les principes de développement, les types de neurones plusieurs comme la colonne vertébrale neurones moteurs 8-12, mésencéphale dopneurones aminergiques 13-15, les cellules rétiniennes neuronales 16,17 ont été efficacement spécifié dans les CSP de l&#39;homme. Cela a été fait en appliquant morphogènes essentiels qui sont importants pour la spécification de ces types de neurones au cours du développement in vivo. D&#39;autres protocoles ont également été élaborées pour promouvoir la différenciation des CSEh dans les neurones en utilisant soit des facteurs supplémentaires tels que les 18-20 petites molécules ou par co-culture avec d&#39;autres types cellulaires pour aider à promouvoir la différenciation 21. Le néocortex humain est très développé et contient de nombreux types cellulaires, y compris les neurones glutamatergiques qui jouent un rôle important dans l&#39;apprentissage, la mémoire et la fonction cognitive 22,23. La première étape pour générer des neurones glutamatergiques dans la culture est de spécifier des cellules progénitrices télencéphaliques. Groupe de Yoshiki Sasai le premier signalé la différenciation dirigée des précurseurs télencéphaliques de la souris CES (mESCs) en utilisant une suspensio sans sérumn culture en présence de DKK1 (qui inhibe la signalisation Wnt) ainsi que LeftyA (qui inhibe la signalisation nodal) 24. Par la suite, plusieurs groupes, dont le nôtre ont également signalé la spécification des précurseurs télencéphaliques du PSC de l&#39;homme dans le sérum 25-27 milieu exempt. La génération des précurseurs télencéphaliques du PSC de l&#39;homme n&#39;exige pas l&#39;utilisation de morphogènes exogènes et l&#39;efficacité dans la production de ces précurseurs est beaucoup plus élevé que celui de mESCs 26,27. Ici, un système chimique définie pour l&#39;induction neurale qui a été bien établi par le groupe de Zhang 7 a été décrite. Sans l&#39;ajout de facteurs exogènes caudalizing, ce protocole génère efficacement les précurseurs télencéphaliques du PSC de l&#39;homme 27. Ces progéniteurs peuvent alors se différencier en progéniteurs dorsales ou ventrales en régulant la signalisation de Wnt et sonic hedgehog (SHH). Les progéniteurs dorsaux peuvent en outre se différencier en neurones glutamatergiques efficiently 27. En outre, ce protocole fonctionne aussi bien pour la génération de neurones glutamatergiques de l&#39;homme iPSCs 28, qui permet de générer des neurones spécifiques du patient qui peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d&#39;action ainsi que des thérapies potentielles pour un large éventail de maladies . De plus, notre système offre également une plate-forme pour explorer le développement et la spécification des divers types de neurones dans le télencéphale.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td>Supplier</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>116K5103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (human)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxg1 antibody</td>
			<td>Dr. Y. Sasai</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb4 antibody (1:50)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>I12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6 antibody (1:5000)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>PAX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB5460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 antibody (1:100)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>100-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>1845-SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>352098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>BD</td>
			<td>353004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9'' glass pipetes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip filters (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5702 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells

Ici, une procédure par étapes pour générer efficacement télencéphaliques neurones glutamatergiques de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) a été décrite. Le processus de différenciation est déclenchée par la rupture des CPP de l&#39;homme en touffes qui complètent pour former des agrégats lorsque les cellules sont placées dans une culture en suspension. Les agrégats sont ensuite cultivées dans un milieu de CSEh jours 1-4 pour permettre une différenciation spontanée. Pendant ce temps, les cellules ont la capacité de devenir l&#39;une des trois feuillets embryonnaires. De 5-8 jours, les cellules sont placées dans un milieu d&#39;induction neurale pour les pousser dans la lignée neuronale. Autour jour 8, les cellules sont autorisés à fixer sur plaque de 6 puits et de se différencier au cours de laquelle la forme des cellules neuro-épithéliale. Ces cellules neuro-épithéliales peuvent être isolés au jour 17. Les cellules peuvent ensuite être conservé sous forme de neurosphères jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à être étalées sur des lamelles. L&#39;utilisation d&#39;un milieu de base sans aucun facteur de caudalizing, les cellules neuro-épithéliales sont précisésd télencéphaliques en précurseurs, qui peuvent ensuite être davantage différenciées en progéniteurs télencéphaliques dorsales et les neurones glutamatergiques efficacement. Dans l&#39;ensemble, notre système offre un outil pour générer des neurones glutamatergiques de l&#39;homme pour les chercheurs d&#39;étudier le développement de ces neurones et les maladies qui les affectent.

Ici, un protocole de différencier les CSP de l&#39;homme dans télencéphaliques neurones glutamatergiques au travers de plusieurs étapes essentielles: la formation d&#39;agrégats de la CFP, l&#39;induction de cellules neuro-épithéliales, la production de progéniteurs télencéphaliques et la différenciation terminale de ces progéniteurs en neurones télencéphaliques (Figure 1) a été décrits. Ce système est robuste et efficace dans la production de progéniteurs des neurones glutamatergique...

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The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Cette procédure donne des neurones télencéphaliques en passant par les points de contrôle qui sont similaires à ceux observés au cours du développement humain. Les cellules peuvent se différencier spontanément, sont exposés à des facteurs qui les poussent vers la lignée neuronale, sont isolés et sont étalées sur des lamelles couvre-objet pour permettre une différenciation terminale et de maturation.

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recherche

Neurosciences

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...