Name: the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00
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저자는 넉넉한 FOXG1 항체를 제공하기 위해 박사 Y. Sasai 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 줄기 세포 연구 기금 (08-SCB-UCHC- 022 및 11-SCB24)과 경직 하반신 마비 재단에 의해 지원되었다.

1. 인간 만능의 줄기 세포 응집체의 세대 (D1-D4) <ol><li> 인간 만능의 줄기 세포는 기본적인 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF, 4 NG / ML)로 보충 hESC 매체의 존재에 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 모이통에 배양되어 있습니다. 문화 5-7일 후, 식민지 큰하지만 여전히 undifferentiated 때, 그들은 다음 단계에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 효소 솔루션 먼저 준비해야합니다. 50 ML 튜브에 DMEM/F12 중간에 1 MG / ML ?...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+specification+in+the+spinal+cord:+inductive+signals+and+transcriptional+codes.">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li><li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+toward+a+unifying+mechanism.">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li><li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells.">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li><li>Lee, H., Shamy, G. 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Res. 55, 223-233 (2006).</li><li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li><li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Pankratz, M. T., Li, X. 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신경 분화 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그것은 그렇지 않으면 세포가 이미 비 neuronal 혈통이되는 방향으로 편향 될 수 있기 때문에 인간 PSCs이 만능 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 같은 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Tra-1-60 1-3로 pluripotency 마커에 대한 항체와 인간의 PSCs 얼룩으로 확인 할 수 있습니다. 인간 PSCs들을 passaging 후 잘 부착하지 않은 경우, ROCK 억제제 (Y27632)가 ?...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 만능의 줄기 세포 (PSCs)는, 뉴런 1-3을 포함하여 몸의 모든 세포 유형을 생성 할 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 인간 PSCs의 다양한 neuronal 하위 유형의 감독 차별화 재생 의료에서​​ 이러한 세포의 응용 프로그램에 대한 키를 보유하고 있습니다. 개발하는 동안 기능 neuronal 하위 유형의 세대는 신경 계통의 유도, rostro - 꼬리 축을 따라 지역 progenitors의 사양, 그리고 4,5 지역 progenitors에서 포스트 mitotic의 신경 세포 유형의 차별화를 포함하는 복잡한 과정이다. 2001 년부터 여러 시스템은 neuronal 하위 유형 6,7의 후속 세대를위한 플랫폼을 제공 hESCs에서 신경 계통을 생성하기 위해 설립되었습니다. 발달 원리, 이러한 척추 모터 뉴런 8-12, midbrain DOP 등 여러 신경 세포 유형에 따라aminergic의 뉴런 13-15, 그리고 신경 망막 세포는 16,17 효율적으로 인간의 PSCs에서 지정된되었습니다. 이것은 생체 개발하는 동안 이러한 신경 세포 유형의 사양에 중요한 중요한 morphogens을 적용하여 이루어졌다. 다른 프로토콜도 차별화 21 홍보하기 위해 같은 작은 분자 또는 다른 세포 유형 공동 배양하여 추가 요소 18-20를 사용하여 뉴런으로 hESCs의 분화를 촉진하기 위해 개발되었습니다. 인간의 네크로은 고도로 발달과 학습, 메모리 및인지 기능 22,23에 중요한 역할을 glutamatergic 뉴런을 포함한 여러 세포 유형을 포함합니다. 문화 glutamatergic 뉴런을 생성하는 첫 번째 단계는 telencephalic 전구 세포를 지정하는 것입니다. Yoshiki Sasai의 그룹은 먼저 혈청 무료 suspensio를 사용하여 마우스 ESCs (mESCs)에서 telencephalic 전구체의 지시 차별화를보고DKK1의 존재 (Wnt 신호를 억제하는)뿐만 아니라 LeftyA (결절 신호를 억제하는) 24의 N 문화. 그 후, 우리를 포함한 여러 그룹은 혈청 무료 매체 25-27에서 인간 PSCs에서 telencephalic 전구체의 사양을보고했습니다. 인간 PSCs에서 telencephalic 전구체의 생성 외인성 morphogens 이러한 전구체를 생성의 효율성의 사용 mESCs 26,27에서보다 훨씬 높은 요구하지 않습니다. 여기 잘 장의 그룹 (7)에 의해 설립 된 신경 유도를위한 화학적으로 정의 된 시스템이 설명되어 있습니다. 외인성 caudalizing 요소의 추가없이,이 프로토콜은 효율적으로 인간의 PSCs 27 일부터 telencephalic 전구체를 생성합니다. 이 progenitors 그런 다음 Wnt와 소닉 고슴도치 (쉬이 잇)의 신호를 조절하여 등쪽이나 복부 progenitors로 구분 될 수있다. 등쪽 progenitors 더 glutamatergic 뉴런 전자로 구분할 수fficiently 27. 또한,이 프로토콜은 또한 질병의 큰 배열에 대한 작업뿐만 아니라 잠재적 인 요법의 메커니즘을 탐구하기 위해 이용 될 수있는 환자 ​​특정 뉴런의 생성을 허용 인간의 iPSCs 28 일에서 glutamatergic 뉴런의 생성을 위해 잘 작동 . 또한, 우리의 시스템은 telencephalon에서 다양한 neuronal 유형의 개발과 사양을 탐험 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td>Supplier</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>116K5103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (human)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxg1 antibody</td>
			<td>Dr. Y. Sasai</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb4 antibody (1:50)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>I12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6 antibody (1:5000)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>PAX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB5460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 antibody (1:100)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>100-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>1845-SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>352098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>BD</td>
			<td>353004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9'' glass pipetes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip filters (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5702 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells

여기 효율적으로 인간의 만능의 줄기 세포 (PSCs)에서 telencephalic glutamatergic 뉴런을 생성하기위한 stepwise 절차가 설명되어 있습니다. 차별화 과정은 세포가 정지 문화에 배치 할 때 응집체를 형성하도록 반올림 clumps에 인간 PSCs을 위반하여 시작됩니다. 집계 그 다음 자연 차별화 할 수 있도록하는 일 1-4에서 hESC 미디어에서 재배되어 있습니다. 이 기간 동안 세포는 세 세균 레이어의 될 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 일 5-8에서 세포는 신경 계통으로 선택을 강요 신경 유도 매체에 배치되어 있습니다. 일 8 주변 셀은 6 잘 접시에 첨부되는 시간 neuroepithelial 세포 양식을하는 동안 차별화 할 수 있습니다. 이 neuroepithelial 세포는 하루에 17 격리 할 수​​ 있습니다. 그들은 coverslips에 도금 할 준비가 될 때까지 전지 그런 다음 neurospheres로 유지 될 수 있습니다. 어떤 caudalizing 요소없이 기본적인 매체를 사용하여 neuroepithelial 전지는 specifie 아르그리고 더 효율적으로 등쪽 telencephalic progenitors과 glutamatergic 뉴런으로 차별화 할 수 있습니다 telencephalic 전구체,에 D. 전반적으로, 우리의 시스템은 이러한 뉴런의 개발과 그 영향을 미치는 질병을 연구하는 연구자에 대한 인간의 glutamatergic 뉴런을 생성 할 수있는 도구를 제공합니다.

여기 프로토콜은 여러 중요한 단계를 telencephalic glutamatergic 뉴런에 인간 PSCs을 차별화 방법 : PSC 집계의 형성은 neuroepithelial 세포의 유도, telencephalic progenitors의 생성 및 telencephalic 뉴런에 해당 progenitors의 터미널 차별화 (그림 1)이 설명되어. 이 시스템은 telencephalic progenitors과 glutamatergic 뉴런의 생성에 강력하고 효율적이다. 예를 들어 (그림 2)으로 caudalizing 요소의 추가없이 h...

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The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

이 절차는 인간의 개발 기간 동안 관찰 것과 유사한 대를 이동하여 telencephalic 뉴런을 산출. 세포는 자발적으로 차별화 할 수있는 신경 계통 기수를 밀어 요인에 노출되어 격리되며, 터미널 차별화과 성숙을 할 수 있도록 coverslips에 도금되어 있습니다.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

연구

신경과학

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...