Name: the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Dr. Y. Sasai para ofrecer generosamente el anticuerpo FOXG1. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de Connecticut de células madre (08-SCB-UCHC- 022 y 11 SCB24-) y la Fundación Paraplejia espástica.

1. Generación de agregados humanos de células madre pluripotentes (D1-D4) <ol><li> Las células madre pluripotentes se cultivan en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) alimentadores en presencia de medio suplementado con hESC factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Después de 5-7 días en cultivo, cuando las colonias son grandes, pero todavía no diferenciado, que están listos para el siguiente paso. </li><li> La primera solución enzimática debe estar preparado. En un tubo de 50 ml,...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., Vodyanik, M. 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H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes.">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Hay varios pasos críticos durante el proceso de diferenciación neural. Es importante asegurarse de que los PSCs humanas son pluripotentes, porque de lo contrario las células que ya pueden estar sesgados hacia convertirse en un linaje no neuronal. Esto se puede confirmar mediante tinción de las PSCs humanos con anticuerpos contra marcadores de pluripotencia, tales como Oct4, Sox2, Nanog, y 1-3 Tra-1-60. Si los CPs humanos no se adhieren muy bien después de pases ellos, inhibidor de ROCK (Y27632) se puede ...

Las células madre pluripotentes (PSC), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), tienen la capacidad de generar cualquier tipo de célula en el cuerpo, incluyendo las neuronas 1-3. Diferenciación dirigida de diversos subtipos neuronales de los CRP humanos es la clave para la aplicación de estas células en la medicina regenerativa. La generación de funcionales subtipos neuronales durante el desarrollo es un proceso complejo que implica la inducción de linaje neuronal, la especificación de los progenitores regionales a lo largo del eje rostro-caudal, y la diferenciación de tipos de neuronas post-mitóticas de los progenitores 4,5 regionales. A partir de 2001, varios sistemas se han establecido para generar linaje neural de hESCs, que han proporcionado una plataforma para la posterior generación de subtipos neuronales 6,7. Sobre la base de los principios de desarrollo, varios tipos de neuronas, como las neuronas espinales motor 8-12, mesencéfalo dopneuronas aminérgicos 13-15, y células de la retina neural 16,17 se han especificado de manera eficiente PSCs humanas. Esto se realizó mediante la aplicación de morfógenos críticos que son importantes para la especificación de estos tipos de neuronas durante el desarrollo in vivo. Otros protocolos también se han desarrollado para promover la diferenciación de hESCs en neuronas usando cualquiera de los factores adicionales 18-20, tales como pequeñas moléculas o mediante el cultivo conjunto con otros tipos de células para ayudar a promover la diferenciación 21. El neocórtex humano está muy desarrollado y contiene muchos tipos de células, incluidas las neuronas glutamatérgicas que desempeñan un papel importante en el aprendizaje, la memoria y la función cognitiva 22,23. El primer paso en la generación de neuronas glutamatérgicas en cultivo es para especificar células progenitoras telencefálicas. Yoshiki Sasai del grupo por primera vez la diferenciación dirigida de precursores telencefálicas de ratón CES (mESCs) utilizando una suspensio libre de sueron cultivo en presencia de DKK1 (que inhibe la señalización de Wnt), así como LeftyA (que inhibe la señalización nodal) 24. Posteriormente, varios grupos incluyendo el nuestro también han informado de la especificación de precursores telencefálicas de PSCs humanos en suero libre de mediano 25-27. La generación de los precursores de los CRP humanos telencefálicas no requiere el uso de morfógenos exógenas y la eficiencia en la generación de estos precursores es mucho mayor que la de mESCs 26,27. Aquí, un sistema químicamente definido para la inducción neural que estaba bien establecida por el grupo de Zhang 7 se ha descrito. Sin la adición de factores exógenos caudalizing, este protocolo eficiente genera precursores telencefálicas de PSCs humanos 27. Estos progenitores entonces se pueden diferenciar en progenitores dorsal o ventral mediante la regulación de la señalización de Wnt y sonic hedgehog (SHH). Las células progenitoras más dorsales pueden diferenciarse en neuronas e glutamatérgicafficiently 27. Además, este protocolo también funciona bien para la generación de neuronas glutamatérgicas de humano iPSCs 28, que permite la generación de pacientes específicos de neuronas que se pueden utilizar para estudiar el mecanismo de acción, así como terapias potenciales para una gran variedad de enfermedades . Por otra parte, nuestro sistema también proporciona una plataforma para explorar el desarrollo y la especificación de los diversos tipos neuronales en el telencéfalo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td>Supplier</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>116K5103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (human)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxg1 antibody</td>
			<td>Dr. Y. Sasai</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb4 antibody (1:50)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>I12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6 antibody (1:5000)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>PAX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB5460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 antibody (1:100)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>100-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>1845-SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>352098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>BD</td>
			<td>353004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9'' glass pipetes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip filters (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5702 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells

Aquí, un procedimiento por etapas para generar eficientemente telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes (PSC) se ha descrito. El proceso de diferenciación se inicia rompiendo las PSCs humanos en terrones que redondear hacia arriba hasta formar agregados cuando las células se colocan en un cultivo en suspensión. Los agregados se hacen crecer entonces en un medio de hESC 1-4 días para permitir la diferenciación espontánea. Durante este tiempo, las células tienen la capacidad de convertirse en cualquiera de las tres capas germinales. De día 5-8, las células se colocan en un medio de inducción neural para empujarlos en el linaje neural. Alrededor de 8 días, las células se dejan adherir a placas de 6 pocillos y se diferencian durante el cual la forma células neuroepiteliales. Estas células neuroepiteliales se puede aislar a día 17. Las células entonces se puede mantener como neuroesferas hasta que estén listos para ser chapada en cubreobjetos. El uso de un medio básico sin ningún factor de caudalizing, células neuroepiteliales son specified en los precursores telencefálicas, que luego pueden diferenciarse también en dorsal progenitores telencefálicas y neuronas glutamatérgicas eficiente. En general, nuestro sistema proporciona una herramienta para generar neuronas glutamatérgicas humanos para los investigadores para estudiar el desarrollo de estas neuronas y las enfermedades que les afectan.

Aquí, un protocolo para diferenciar los CRP humanos en telencefálicas neuronas glutamatérgicas a través de varios pasos críticos: la formación de agregados PSC, la inducción de células neuroepiteliales, la generación de los progenitores telencefálicas, y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas telencefálicas (Figura 1) tiene han descrito. Este sistema es robusto y eficiente en la generación de los progenitores y neuronas glutamatérgicas telencefálicas. Como un ejemplo...

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The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Investigación

Neurociencias

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...