Name: in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00
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Wir danken Drs. Arata Tabuchi und Wolfgang Kübler (University of Toronto) für den Unterricht über Intravitalmikroskopie. Wir danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) für die Unterstützung in der Mikroskopie Design und Implementierung. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschüsse P30 HL101295 und K08 HL105538 (auf EPS) finanziert.

Ein. Vorbereitung der Surgical Tubing, Gefäßkathetern, Brust Wand Fenster <ol><li> Intravitalmikroskopie Bühne. Wir maßgeschneiderte eine Plexiglas Bühne, auf der die narkotisierten Maus liegt in der Mikroskopie. Diese Phase nimmt sowohl ein 15 cm x 10 cm flexible Kunststoff-Schneidebrett (auf dem die Maus liegt bei der Induktion der Anästhesie, Tracheotomie Platzierung und Katheterisierung) sowie einer ähnlich großen Heizelement (unter der Schneidebrett). </li><li> Maus Thorakostomie ...

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	<li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung.">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li><li>Florian, J. 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Koinzident mit dem expandierenden Verwendung von in vivo-Mikroskopie, gibt es zunehmende Wertschätzung sowohl für die beträchtliche Größe der ESL sowie dessen zahlreichen Beiträge Gefäßfunktion. Diese neuen Daten werden jedoch vor allem aus Studien der systemische Gefäßsystem abgeleitet. In der Tat, der in vivo-Mikroskopie in der Lunge zu verwenden ist technisch anspruchsvoll, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Mehrere neuere technische For...

Die endotheliale Glykokalyx ist ein extrazelluläres Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden der vaskulären Intima. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer Oberflächenschicht wesentlichen endothelialen (ESL), die eine Vielzahl von Funktionen einschließlich Endothelzellen Fluiddurchlässigkeit 1, Neutrophilen-Endothel reguliert Haftung 2 und die Mechanotransduktion von Fluid Scherbeanspruchung 3. Historisch gesehen hat die Glykokalyx war underappreciated aufgrund seiner aberrance in kultivierten Zellpräparationen 4, 5 und seine Abbauprodukte während der üblichen Gewebefixierung und Verarbeitung 6. Der zunehmende Einsatz 7 von Intravitalmikroskopie (in vivo Mikroskopie, IVM) hat mit erhöhter wissenschaftliche Interesse an der Bedeutung der ESL auf vaskuläre Funktion bei Gesundheit und Krankheit zusammenfiel. Die ESL ist unsichtbar für Lichtmikroskopie und kann nicht einfach in beschriftbarvivo, da die Neigung der fluoreszierenden Glykokalyx-bindenden Lektine RBC Agglutination 8 und tödlichen Lungenembolien (unveröffentlichte Beobachtungen) verursachen. Mehrere indirekte Ansätze wurden daher entwickelt, um ESL Dicke (und durch Erweiterung, Glykokalyx Integrität) in unbewegten Gefäßbetten wie die cremasterica und mesenterialen microcirculations abzuleiten. Diese Techniken umfassen die Messung der Differenzen der zirkulierenden Mikropartikel Geschwindigkeit als eine Funktion des Abstands von der endothelialen Membran (Mikropartikel Bild velocimetry 9) sowie die Messung der Ausschluss von sperrigen, fluoreszenzmarkierten vaskulären Markern (zB Dextrane) von der endothelialen Oberfläche (Dextran Exklusionstechnik 10, 11). Von diesen Techniken ist nur Dextran Ausschluss fähig Schätzen ESL Dicke aus Messungen an einem einzigen Zeitpunkt hergestellt. Durch die gleichzeitige Messung vaskulärer Breiten mit Hellfeldmikroskopie (a Breite inclusive der &quot;unsichtbaren&quot; ESL) und Fluoreszenz-Mikroskopie eines vaskulären Tracer vom ESL ausgeschlossen, kann ESL Dicke wie die Hälfte der Differenz zwischen vaskulären Breiten 2 berechnet werden. Die Verwendung von einem momentanen Maß für ESL Dicke für Studium des pulmonalen Glykocalix gut geeignet. Intravitalmikroskopie der Lunge ist eine Herausforderung, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während jüngsten Fortschritte zur Immobilisierung Mauslungen ermöglichen in vivo 12, 13, bestehen Bedenken hinsichtlich der physiologischen Auswirkungen von Lungen Stasis. Lung Immobilität wird mit einer verminderten endothelialen Stickstoffmonoxid Signalisierung 14, ein Signalweg, der sowohl Neutrophilen Adhäsion 15 und Lungenschädigung 16 Auswirkungen verbunden. Weiterhin Immobilisierung eines Bereichs von Lungen freilegt umgebenden mobilen Alveolen zu schädigenden Scherkräften (sogenannte &quot;Atelektrauma&quot;), in Übereinstimmung mit den Konzepten der klassischen physiologischenalveolären Interdependenz 17. Im Jahre 2008 entwickelte Arata Tabuchi, Wolfgang Kübler und Kollegen eine chirurgische Technik die es erlaubt Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge 18. Respiratorischen Artefakt aus diesem Verfahren kann durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Abbildungssystem, einschließlich gleichzeitige Messung von Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie negiert werden. In diesem Bericht ausführlich wir, wie momentane Dextran Ausschluss Bildgebung eingesetzt werden, um ESL Dicke im subpleural Mikrozirkulation einer frei beweglichen, in vivo Mauslunge messen. Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um zu bestimmen Glykokalyx-Funktion Insbesondere die Fähigkeit eines intakten ESL auszuschließen zirkulierenden Elemente aus der endothelialen Oberfläche. Wir haben kürzlich diese Techniken verwendet werden, um die Bedeutung der pulmonalen ESL Integrität zur Entwicklung von akutem Lungenversagen während systemische entzündliche Erkrankungen wie Sepsis 2 zu bestimmen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Name des Reagenz </td></tr><tr><td> FITC-Dextran (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-Dextran (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-beschichtete fluoreszierenden Mikrosphären </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragon Green Fluoreszenz (ähnlich FITC) </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1-Antikörper biotinylierter </td><td> eBioscience </td><td> Klonen YN1/1.7.4 </td><td> 1:50 Verdünnung </td></tr><tr><td> Isotyp biotinylierten Antikörper </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> 1:50 Verdünnung </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Beatmungsgerät </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Tracheostomie Katheters </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrokauter Gerät </td><td> DRE Medical </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Bipolar Kauter Pinzette </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200i </td><td> 9.9cm McPherson </td></tr><tr><td> Temperatur control-System </td><td> World Precision Instruments </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Pumpe 11 Elite </td><td></td></tr><tr><td> Microscope (Weitfeld) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope (konfokalen) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Bild Splitter </td><td> Photometrics </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Bildverarbeitungs-Software </td><td> Nikon </td><td> NIS Elements </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylidenfluorid-Membran </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Circular Deckglas </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, Nr. 1 Dicke </td></tr><tr><td> Glue (Deckglas zur Membran) </td><td> Pattex </td><td> Flüssig (liquid) </td><td> Zum Aufkleben Deckglas zur Membran </td></tr><tr><td> Glue (Deckglas zur Maus) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Membran zum Anbringen an Maus </td></tr><tr><td> Chirurgische Schläuche </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Naht </td><td> Fischer </td><td></td><td> 04.00 Seide </td></tr><tr><td> Trockenrasierer </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Zange gekrümmten </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gerade chirurgische Pinzette </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Schere </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Mikroschere </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Nadeltreiber </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Surgical tape </td><td> Fischer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kitchen sponges (Schnitt in Keile) </td><td> verschiedene </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden des Gefäßlumens. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer erheblichen endothelialen Oberflächenschicht (ESL), die zur Aufrechterhaltung der endothelialen Funktion beiträgt. Als die endotheliale Glykokalyx ist oft aberrante in vitro und ist während der normalen Gewebe Fixationstechniken verloren, benötigt Studie der ESL Verwendung von Intravitalmikroskopie. Um die beste Annäherung an die komplexen Physiologie des alveolären Mikrovaskulatur wird pulmonalen intravital Bildgebung ideal auf einem frei beweglichen Lungenkrebs durchgeführt. Diese Zubereitungen jedoch typischerweise unter umfangreichen Bewegungsartefakt. Wir zeigen, wie mit geschlossenem Brustkorb Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge verwendet werden, um Glykocalix Integrität mittels ESL Ausschluss von fluoreszenzmarkierten hochmolekularen Dextrane aus der endothelialen Oberfläche zu messen. Diese Nichtwiedereinziehung chirurgische Technik, die benötigtgleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung der Maus Lunge, ermöglicht Längs Beobachtung des subpleural Mikrovaskulatur ohne Beweise zu induzieren confounding Lungenschädigung.

Der experimentelle Ansatz in den Schritten 1-6 beschrieben ermöglichen Erfassung von mehreren Frames gleichzeitiger DIC (Hellfeld) und fluoreszierende Bilder. Um ESL Dicke zu bestimmen, werden aufgenommene Bilder mit einer Blindbeobachter nach Beendigung des experimentellen Protokolls bewertet. Mit Hilfe eines in-Fokussierrahmen subpleural Mikrogefäßen (&lt;20 Mikrometer Durchmesser) identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen sind in der Regel auf einem einzigen Rahmen (Abbildung 10). Mit Bildanalyse...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen<em&gt; In vivo</em&gt; Maus Lunge.

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Angiogenese im ischämischen Rat Lung

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Forschung

Medizin

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technische Aspekte der Maus aortokavaler Fistel

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Echokardiographische Beurteilung des rechten Herzens bei Mäusen

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

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Die Messung der Druck-Volumen-Kurve in der Mäuselunge

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

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Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

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Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...