Name: in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00
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우리는 Drs 감사드립니다. Arata 타 부치와 intravital 현미경에 관한 교육을위한 볼프강 Kuebler (토론토 대학). 우리는 현미경 설계 및 구현에 도움을 앤드류 케이힐 (니콘 인스트루먼트)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NHLBI 보조금 P30 HL101295와 K08 HL105538 (EPS로)에 의해 재정 지원되었다.

1. 외과 배관, 혈관 카테터, 가슴 벽 창의 작성 <ol><li> Intravital 현미경 단계. 우리는 anesthetized 마우스가 현미경 동안 자리 잡고있는시 플렉시 글라스 단계를 주문했습니다. 이 단계는 10cm 유연한 플라스틱 가공 보드 (마우스를 마취의 유도, tracheostomy 배치, 및 정맥 catheterization 동안 자리 잡고있는시)뿐만 아니라 유사한 크기의 가열 요소 (도마 아래에있는)에 의해 15cm를 모두 수용 할 수...

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	<li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung.">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li><li>Florian, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules,+Erythrocytes,+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries.">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circ. Res. 79, 581-589 (1996).</li><li>Marechal, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+glycocalyx+damage+during+endotoxemia+coincides+with+microcirculatory+dysfunction+and+vascular+oxidative+stress.">Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress.</a> Shock. 29, 572-576 (2008).</li><li>Presson, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Lung+Injury+Causes+Pendelluft+Between+Adjacent+Alveoli+In+Vivo.">Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).</li><li>Roebuck, K. A., Finnegan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1+(CD54)+gene+expression.">Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).</li></ol>

생체 현미경에서의 확장 사용과 일치, ESL의 상당한 크기뿐만 아니라 혈관 기능에 수많은 공헌을 모두 증가 감사가 있습니다. 이 새로운 데이터는하지만, 주로 전신 vasculature의 연구에서 파생됩니다. 사실, 폐에 생체 현미경의 사용 기술적으로 주어진 중요한 폐와 심장 모션 유물은, 도전하고 있습니다. 여러 최근의 기술 진보는 폐 microcirculation 12, 13에 int...

내피 glycocalyx은 혈관 intima 릴 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 세포 층입니다. 생체에서 glycocalyx는 호중구 - 내피 유체 투과성 1 등의 내피 기능의 다양한 규제 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 높은 수화입니다 접착 2, 유체 전단 응력의 ​​3 mechanotransduction. 역사적으로, glycocalyx 인해 표준 조직 고정 및 처리 6시 배양 세포 준비 4, 5 및 저하에서의 aberrance에 무시받는되었습니다. 증가 사용 intravital 현미경의 7 (생체 현미경에 IVM) 건강과 질병 중 혈관 기능에 ESL의 중요성에 상승 과학적 관심과 일치하고 있습니다. ESL은 빛 현미경에 보이지 않는과 쉽게 표시 할 수 없습니다적혈구 응집 8 치명적인 폐 emboli (게시되지 않은 관찰)을 일으킬 수있는 형광 glycocalyx 바인딩 lectins의 성향에 주어진 생체. 여러 간접적 인 방법 따라서 예를 cremasteric과 창 자간 막 microcirculations 같은 비 이동 혈관 침대에서 ESL 두께 (및, 확장하여, glycocalyx 무결성)을 추론하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 내피 표면에서 내피 막 (microparticle 이미지 velocimetry 9)뿐만 아니라 부피가 큰, 휘황 - 라벨 혈관 마커 (예 : dextrans)의 배제의 측정에서 거리의 함수로 microparticle 속도를 순환의 차이의 측정을 포함 (dextran 제외 기술 10, 11). 이러한 기술 중 단 dextran 제외 시간에 하나의 시점에서 만들어진 측정에서 ESL의 두께를 추정 할 수 있습니다. 동시에에 brightfield 현미경 (폭을 사용하여 혈관 폭을 측정하여&quot;눈에 보이지 않는&quot;ESL)과 ESL에서 제외 혈관 추적의 형광 현미경의 clusive, ESL 두께는 혈관 폭 2 ~ 한 반 차이로 계산 될 수있다. ESL 두께의 순간 측정의 사용은 폐 glycocalyx 연구에 적합합니다. 폐의 Intravital 현미경은 크게 폐와 심장 모션 아티팩트 주어진 도전입니다. 최근 진보 생체 12, 13에 마우스 폐의 고정을 허용하지만, 문제는 폐 정지 physiologic 미치는 영향에 관한 존재합니다. 폐 부동는 14 신호 감소 내피 질소 산화물, 호중구 부착 15 폐 부상 16에 모두 영향을 신호 경로와 연결되어 있습니다. 또한,의 고전 physiologic 개념에 따라 폐 유해한 전단 세력 ( &quot;atelectrauma&quot;소위)에 모바일 폐포를 둘러싼 노출의 지역의 고정,폐포 상호 의존성 17. 2008 년 Arata 타 부치, 볼프강 Kuebler와 동료는 자유롭게 움직이는 마우스 폐 18 intravital 현미경을 허용하는 수술 기술을 개발했다. 이 기법에서 발생하는 호흡기 유물은 brightfield과 형광 현미경의 동시 측정 등의 고속 이미지의 사용에 의해 무효가 될 수 있습니다. 순간 dextran 제외 이미징은 생체에서 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 subpleural microcirculation에서 ESL의 두께를 측정하는 고용 할 수있는 방법을이 보고서에서, 우리는 자세히 설명합니다. 이 기술은 쉽게 함수 구체적으로 glycocalyx를 결정하기 위해 내피 표면에서 요소를 순환 제외 할 수 ESL 그대로의 능력을 수정할 수 있습니다. 우리는 최근에는 패혈증이 같은 전신 염증 질환 중 급성 폐 손상의 발전에 폐 ESL 무결성의 중요성을 결정하기 위해 이러한 기술을 사용했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약의 이름 </td></tr><tr><td> FITC-dextran (150 kDa) </td><td> 시그마 </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextran (150 kDa) </td><td> 시그마 </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-코팅 형광 마이크로 </td><td> 앞머리 연구소 </td><td> CP01F/10428 </td><td> 드래곤 녹색 형광 (FITC와 유사) </td></tr><tr><td> 케타민 </td><td> 무어 의료 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 무어 의료 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 반 (反) ICAM-1 biotinylated 항체 </td><td> eBioscience </td><td> YN1/1.7 복제.4 </td><td> 1시 50분 희석 </td></tr><tr><td> biotinylated 항체를 Isotype </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> 1시 50분 희석 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 기계 환풍기 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 영감 </td><td></td></tr><tr><td> Tracheostomy 카테터 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Electrocautery 장치 </td><td> 드레 의료 </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> 양극성 소작 포셉 </td><td> 올슨 의료 </td><td> 10 1200I </td><td> 9.9cm 맥 피어슨이 </td></tr><tr><td> 온도 contro리터 시스템 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 펌프 (11) 엘리트 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 (widefield) </td><td> 니콘 </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 (공 촛점) </td><td> 니콘 </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 스플리터 </td><td> Photometrics </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 처리 소프트웨어 </td><td> 니콘 </td><td> NIS 요소 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 염화 비닐 막 </td><td> 구레 WRAP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 원형 커버 슬립 </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5mm, # 1 두께 </td></tr><tr><td> 접착제 (막에 슬립을 커버) </td><td> Pattex </td><td> Flussig (액체) </td><td> 막에 커버 슬립을 affixing에 대한 </td></tr><tr><td> 접착제 (마우스 슬립을 커버) </td><td> Pattex </td><td> 젤라틴 </td><td> 마우스 멤브레인을 부착 </td></tr><tr><td> 외과 튜브 </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> 상처의 봉합 </td><td> 어부 </td><td></td><td> 4시 실크 </td></tr><tr><td> 전기 면도기 </td><td> Oster </td><td> 78,997 </td><td></td></tr><tr><td> 구부러진 외과 포셉 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 스트레이트 외과 포셉 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 가위 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 microscissors </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 바늘 드라이버 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 테이프 </td><td> 어부 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 주방 스폰지 (웨지로 잘라) </td><td> 여러 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

내피 glycocalyx은 혈관 내강을 늘어서 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 층이다. 생체에서 glycocalyx은 내피 기능의 유지에 기여 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 매우 충분한 것입니다. 내피 glycocalyx가 자주 체외에서 탈선 및 표준 조직 고정 방법 중에 손실 된 바와 같이, ESL의 연구는 intravital 현미경의 사용이 필요합니다. 폐포 microvasculature의 가장 대략적인 복잡한 생리에, 폐 intravital 영상은 이상적으로 자유롭게 움직이는 폐에 수행됩니다. 이러한 준비는하지만, 일반적으로 광범위한 운동의 유물로 고통 받고 있습니다. 우리는 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 폐 가슴 intravital 현미경은 내피 표면에서 휘황 - 라벨 고분자 체중 dextrans의 ESL 제외 통해 glycocalyx 무결성을 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 필요이 아닌 복구 수술 기법,동시 brightfield와 마우스 폐의 형광 이미징은 혼란 폐 부상을 일으킬 증거도없이 subpleural microvasculature의 길이 방향 관찰 할 수 있습니다.

단계 1-6에 설명 된 실험 방법은 동시 DIC (brightfield) 및 형광 이미지의 여러 프레임 캡처를 할 수 있습니다. ESL 두께를 확인하려면 녹음 이미지는 실험 프로토콜의 완료 후에 눈을 멀게 관찰자에 의해 검토됩니다. 포커스에 프레임이, subpleural microvessels가 (&lt;20 μm 직경) 식별을 사용하여, 최소 3 microvessels는 일반적으로 하나의 프레임 (그림 10)에서 찾을 수 있습니다. 이미지 분석 소프트?...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 - 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을 보여줍니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 마우스 폐.

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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