Name: in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00
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Agradecemos os drs. Arata Tabuchi e Wolfgang Kuebler (Universidade de Toronto) para a instrução sobre microscopia intravital. Agradecemos Andrew Cahill (Nikon Instruments) para obter ajuda na concepção e implementação de microscopia. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NHLBI concede P30 HL101295 e K08 HL105538 (para EPS).

1. Preparação de tubo cirúrgico, cateteres vasculares, Janela parede torácica <ol><li> Fase microscopia intravital. Nós custom-made um estágio plexiglass em que o rato anestesiado reside durante microscopia. Esta fase acomoda ambos de 15 cm por 10 centímetros placa de corte de plástico flexível (sobre a qual o rato se encontra durante a indução da anestesia, a colocação de traqueostomia, e cateterização venosa), bem como um elemento de aquecimento de tamanho semelhante (localizado por b...

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	<li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung.">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li><li>Florian, J. 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Coincidente com a crescente utilização de microscopia em vivo, não há reconhecimento crescente de tanto o tamanho substancial do ESL, bem como as suas numerosas contribuições para a função vascular. Estes dados emergentes, no entanto, são principalmente derivados de estudos do sistema vascular sistémica. Na verdade, o uso de em microscopia vivo no pulmão é tecnicamente desafiador, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca. Vários últi...

O glycocalyx é uma camada endotelial extracelular de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem a íntima vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL) que regula várias funções endoteliais incluindo a permeabilidade do fluido 1, neutrófilos endotelial adesão 2, e a tensão de 3 mecanotransdução fluido de cisalhamento. Historicamente, tem sido o glicocálice underappreciated devido à sua aberrance em preparações de células de cultura 4, 5 e a sua degradação durante a fixação do tecido normal e de processamento 6. O uso crescente de 7 microscopia intravital (em microscopia vivo, IVM) coincidiu com elevado interesse científico na importância do ESL para a função vascular durante a saúde e na doença. O ESL é invisível para microscopia de luz e não pode ser facilmente rotulado devivo, dada a propensão do glicocálice fluorescentes de ligação de lectinas para provocar a aglutinação de glóbulos vermelhos 8 e embolia pulmonar fatal (observações não publicadas). Várias abordagens indiretas, por isso, foi desenvolvido para deduzir ESL espessura (e, por extensão, a integridade glicocálice), não-móveis leitos vasculares, como os microcirculations cremastérico e mesentérica. Estas técnicas incluem a medição de diferenças de velocidade de circulação de micropartículas como uma função da distância a partir da membrana endotelial (velocimetria de micropartículas imagem 9), bem como a medição da exclusão de volumosos, fluorescentemente marcadas com marcadores vasculares (por exemplo, dextranos), a partir da superfície endotelial (técnica de exclusão de dextrano 10, 11). Destas técnicas, apenas a exclusão de dextrano é capaz de estimar a espessura ESL partir de medições feitas em um único ponto no tempo. Ao medir simultaneamente larguras vasculares utilizando microscopia de campo claro (a largura emclusive do &quot;invisível&quot; ESL) e microscopia de fluorescência de um marcador vascular excluídos do ESL, ESL espessura pode ser calculada como a metade da diferença entre as larguras vasculares 2. O uso de uma medida instantânea de espessura ESL é bem adequado para o estudo do glicocálice pulmonar. Microscopia intravital do pulmão é um desafio, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca. Embora os avanços recentes permitem a imobilização dos pulmões do rato, in vivo 12, 13, existam preocupações quanto ao impacto fisiológico do pulmão estase. Imobilidade pulmonar está associado com o óxido nítrico endotelial diminuiu de sinalização 14, uma via de sinalização que afeta tanto a adesão de neutrófilos e lesão pulmonar 15 16. Além disso, a imobilização de uma área de pulmão expõe circundante alvéolos móveis prejudiciais forças de cisalhamento (o chamado &quot;atelectrauma&quot;), de acordo com os conceitos clássicos fisiológicosinterdependência alveolar 17. Em 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e seus colegas desenvolveram uma técnica cirúrgica que permite microscopia intravital de um pulmão de rato livremente em movimento 18. Artefato respiratória decorrente desta técnica pode ser negada pela utilização de imagens em alta velocidade, incluindo a medição simultânea de campo claro e microscopia de fluorescência. Neste relatório, como pormenor, a exclusão de imagem instantânea de dextrano pode ser utilizado para medir a espessura ESL na microcirculação subpleural do pulmão do rato livremente movendo, in vivo. Esta técnica pode ser facilmente modificado para determinar a função glicocálice, especificamente, a capacidade de um intacto ESL para excluir circulante elementos a partir da superfície endotelial. Recentemente temos usado essas técnicas para determinar a importância da integridade ESL pulmonar para o desenvolvimento de lesão pulmonar aguda durante as doenças inflamatórias sistémicas tais como sépsis 2.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> FITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina revestida microesferas fluorescentes </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragão Verde fluorescência (semelhante a FITC) </td></tr><tr><td> Cetamina </td><td> Moore Médica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Moore Médica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1 anticorpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> Clonar YN1/1.7.4 </td><td> Diluição 1:50 </td></tr><tr><td> Isotipo de anticorpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> Diluição 1:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> Ventilador mecânico </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Cateter traqueostomia </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Aparelho de eletrocautério </td><td> DRE Médica </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Cautério bipolar fórceps </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200I </td><td> 9,9 centímetros McPherson </td></tr><tr><td> Temperatura control sistema </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Elite bomba 11 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio (campo amplo) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio (confocal) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Image Splitter </td><td> Fotometria </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> Fotometria </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Software de processamento de imagem </td><td> Nikon </td><td> Elementos NIS </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de polivinilideno </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamela circular </td><td> Bélico </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, # 1 espessura </td></tr><tr><td> Cola (tampa de deslizamento de membrana) </td><td> Pattex </td><td> Flussig (líquido) </td><td> Para a aposição lamínula à membrana </td></tr><tr><td> Cola (tampa de deslizamento de mouse) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Para a fixação da membrana de rato </td></tr><tr><td> Tubo cirúrgico </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Pescador </td><td></td><td> 04:00 seda </td></tr><tr><td> Barbeador elétrico </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Curvas pinça cirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Retas pinça cirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tesouras cirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtesoura cirúrgicos </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorista agulha cirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fita cirúrgica </td><td> Pescador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esponjas de cozinha (cortadas em fatias) </td><td> vário </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

O glycocalyx é uma camada endotelial de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem o lúmen vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL), que contribui para a manutenção da função endotelial. À medida que o glicocálice endotelial é muitas vezes aberrante in vitro e é perdida durante as técnicas de fixação de tecidos normais, o estudo do ESL requer o uso de microscopia intravital. Para melhor a fisiologia do complexo aproximado da microvasculatura alveolar, imagens intravital pulmonar está idealmente realizada em um pulmão livremente movimento. Estas preparações, no entanto, geralmente sofrem de artefacto de movimento extensivo. Demonstramos como de tórax fechado de microscopia intravital de um pulmão de rato livremente móvel pode ser usado para medir a integridade glicocálice via ESL exclusão de fluorescentemente marcadas com dextranos de elevado peso molecular a partir da superfície endotelial. Esta técnica não-recuperação cirúrgica, que requerbrightfield simultânea e de imagem de fluorescência do pulmão do rato, permite a observação longitudinal da microvasculatura subpleural sem evidência de induzir lesão pulmonar confusão.

A abordagem experimental descrito nos passos 1-6 permite a captura de quadros múltiplos de DIC simultânea (campo claro) e as imagens fluorescentes. Para determinar a espessura da ESL, imagens gravadas são analisadas por um observador cego, após conclusão do protocolo experimental. Usando uma moldura de focagem, microvasos subpleural (&lt;20 um de diâmetro) são identificados; pelo menos 3 microvasos são normalmente encontrados numa estrutura única (Figura 10). Usando o software de análise de im...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento livremente<em&gt; In vivo</em&gt; Pulmão do rato.

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

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