Name: in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00
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Agradecemos a los Dres. Arata Tabuchi y Wolfgang Kuebler (Universidad de Toronto) para la instrucción con respecto a la microscopía intravital. Damos las gracias a Andrew Cahill (Nikon Instruments) para la asistencia en el diseño e implementación de microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH / NHLBI subvenciones P30 HL101295 y K08 HL105538 (a EPS).

1. Preparación de tubos quirúrgicos, catéteres vasculares, Ventana pared torácica <ol><li> Etapa microscopía intravital. Hemos hecho a medida de una etapa de plexiglás sobre la que se encuentra el ratón anestesiado durante la microscopía. Esta etapa se adapta tanto a un 15 cm por 10 cm flexible, tabla de cortar de plástico (en la que el ratón se encuentra durante la inducción de la anestesia, la colocación de traqueotomía, y el cateterismo venoso), así como un elemento de calentamiento d...

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	<li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung.">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li><li>Florian, J. 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Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco. Varios avances...

El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido 1, neutrófilos endotelial adhesión 2, y 3 de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante. Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de 4, 5 y su degradación durante la fijación del tejido estándar y de procesamiento 6. El creciente uso de la microscopía intravital 7 (microscopía in vivo, IVM) ha coincidido con mayor interés científico en la importancia de la ESL para la función vascular en la salud y la enfermedad. El ESL es invisible para microscopía de luz y no pueden ser fácilmente etiquetados enin vivo, dada la propensión de fluorescentes glicocálix lectinas de unión a causar aglutinación de RBC 8 y embolia pulmonar no fatal (observaciones no publicadas). Varios enfoques indirectos, se han desarrollado para deducir espesor ESL (y, por extensión, la integridad glicocáliz) que no se mueven en los lechos vasculares tales como los microcirculations cremastéricos y mesentérica. Estas técnicas incluyen la medición de las diferencias en la velocidad de circulación de micropartículas como una función de la distancia de la membrana endotelial (velocimetría de imagen de micropartículas 9), así como la medición de la exclusión de los voluminosos, marcadas con fluorescencia marcadores vasculares (por ejemplo dextranos) de la superficie endotelial (técnica de exclusión de dextrano 10, 11). De estas técnicas, sólo la exclusión de dextrano es capaz de estimar ESL espesor de las mediciones realizadas en un solo punto en el tiempo. Midiendo simultáneamente anchuras vasculares usando microscopía de campo claro (una anchura enconcluyente de la &quot;invisible&quot; ESL) y microscopía de fluorescencia de un trazador vascular excluidos de la ESL, espesor ESL se puede calcular como la mitad de la diferencia entre las anchuras de 2 vasculares. El uso de una medida instantánea de espesor ESL es muy adecuado para el estudio de la glicocálix pulmonar. Microscopía intravital del pulmón es un reto, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardiaca. Aunque los avances recientes permiten la inmovilización de los pulmones del ratón in vivo 12, 13, existen dudas acerca del impacto fisiológico de pulmón estasis. Inmovilidad de pulmón se asocia con disminución de óxido nítrico endotelial señalización 14, una vía de señalización que afecta tanto a la adhesión de neutrófilos 15 y lesión pulmonar 16. Además, la inmovilización de un área de pulmón expone que rodea a los alvéolos móviles perjudiciales fuerzas de cizallamiento (la denominada &quot;atelectrauma&quot;), de acuerdo con los conceptos clásicos fisiológicos deinterdependencia alveolar 17. En 2008, Arata Tabuchi, Kuebler Wolfgang y sus colegas desarrollaron una técnica quirúrgica que permite la microscopía intravital de un pulmón de ratón con libertad de movimiento 18. Artefacto respiratorio resultante de esta técnica puede ser negado por el uso de imágenes de alta velocidad, incluyendo la medición simultánea de campo claro y microscopía fluorescente. En este informe, se detalle cómo imagen instantánea exclusión dextrano se puede emplear para medir el espesor de ESL en la microcirculación subpleural de un pulmón de ratón de libre movimiento, in vivo. Esta técnica se puede modificar fácilmente para determinar glicocálix función, específicamente, la capacidad de un intacta ESL para excluir circulante elementos de la superficie endotelial. Recientemente hemos usado estas técnicas para determinar la importancia de la integridad pulmonar ESL para el desarrollo de lesión pulmonar aguda durante enfermedades inflamatorias sistémicas tales como sepsis 2.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nombre de Reactivo </td></tr><tr><td> FITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Recubiertas de estreptavidina microesferas fluorescentes </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragón verde fluorescente (similar a FITC) </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1 anticuerpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> Clonar YN1/1.7.4 </td><td> Dilución 1:50 </td></tr><tr><td> Isotipo de anticuerpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> Dilución 1:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Ventilador mecánico </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Traqueostomía catéter </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Aparato de electrocauterización </td><td> DRE Medical </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Cauterio bipolar fórceps </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200i </td><td> 9.9cm McPherson </td></tr><tr><td> Temperatura control sistema </td><td> World Precision Instruments </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de jeringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Bomba Elite 11 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio (campo amplio) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio (confocal) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Imagen divisor </td><td> Fotometría </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD cámara </td><td> Fotometría </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Software de procesamiento de imagen </td><td> Nikon </td><td> Elementos NIS </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de polivinilideno </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos circular </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, # 1 espesor </td></tr><tr><td> Pegamento (cover slip a la membrana) </td><td> Pattex </td><td> Flüssig (líquido) </td><td> Para fijar cubreobjetos a la membrana </td></tr><tr><td> Pegamento (cubierta deslizante para el ratón) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Para la fijación de la membrana de ratón </td></tr><tr><td> Tubo quirúrgico </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Pescador </td><td></td><td> Seda 04:00 </td></tr><tr><td> Rasuradora eléctrica </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Curvados fórceps quirúrgico </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Straight pinzas quirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro tijeras quirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Conductor aguja quirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cinta quirúrgica </td><td> Pescador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esponjas de cocina (cortado en trozos) </td><td> vario </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.

El método experimental descrito en los pasos 1-6 se permitir la captura de fotogramas múltiples de DIC simultánea (claro) y las imágenes fluorescentes. Para determinar el espesor ESL, las imágenes grabadas se revisan por un observador ciego después de la finalización del protocolo experimental. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (&lt;20 m de diámetro) se identifican, por lo menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo cuadro (Figura 10). El uso de software de análi...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo<em&gt; In vivo</em&gt; Pulmón de ratón.

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Investigación

Medicina

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Aspectos técnicos de la aortocava Fístula Ratón

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Evaluación ecocardiográfica de la parte derecha del corazón en ratones

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

Medición de la curva de presión-volumen en mouse Pulmones

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

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Telemetría intrauterina para medir la presión del ratón contráctil<em&gt; En Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

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Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

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An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...