Name: isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants at JoVE.com

Estamos gratos pelo apoio do NIH (números Prêmio R00 NS072192 para MKL, HD029178 para AS.L., e 2 RO1 NS032457 para CAW). MKL é o destinatário de Boston das Crianças Carreira de Desenvolvimento da Irmandade Hospital / Harvard Medical Fellowship Shore School e membro da Fundação Alfred P. Sloan. CAW é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

1. Isolamento embrião / Preparação Esta técnica pode ser usada para ratinho ou rato. Neste protocolo que demonstram a técnica de coleta de LCR e dissecção explante cortical cerebral com o cérebro de rato embrionário. Vamos comentar sobre eventuais diferenças importantes para ratos contra ratos que existem dentro das técnicas gerais. Para o sistema de teste idade embrionária, E1 é classificado como o dia da ficha para ratos, E0.5 e é classificado como o dia da ficha para os ratos....

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	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li><li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid.">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li><li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure.">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li><li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface.">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li><li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li><li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

O método descrito para a recolha ventricular CSF produziu amostras relativamente puras de CSF embrionário com composição e actividade da proteína estável consistente em uma série de ensaios celulares 9. Com uma técnica boa coleção e tamanho de leitegada de 10 E14.5 ratos, pode-se esperar para coletar 10-15 ul da CSF, e de uma ninhada de ratos E16, pode-se esperar para coletar cerca de 50-90 ul da CSF. Esta técnica minimiza a contaminação a partir de recolha de sangue e de tecidos, por meio de obs...

A CSF é um fluido complexo que banha o neuroepitélio desenvolvimento 1-6 e fornece 7 pressão essenciais e promover o crescimento pistas para o cérebro em desenvolvimento 8-12. Para o estudo da CSF ao longo do desenvolvimento do cérebro, desenvolvemos técnicas para isolar CSF ventricular de desenvolvimento de embriões de rato ou mouse durante vários estágios de desenvolvimento 6,9. Os métodos anteriores de isolamento incluiu o uso de um vidro de micro-agulha e isolando o CSF utilizando um micro-injector 1,2. O nosso método utiliza uma pipeta de vidro de micro-capilar, cuja ponta foi puxado para criar um ponto de penetração do tecido ultrafinas melhorada. A pipeta de vidro de micro-capilar é ligado a um aspirador, de modo que recolha CSF ventricular pode ser controlada com mudanças suaves de pressão. Para investigar a influência de células-tronco de sinais LCR, dissecamos cerebrais corticais explantes, colocá-los em membranas de policarbonato, e flutuar-los no cu apropriadasLTURE meio suplementado com 9 amostras de LCR. Com esta técnica, uma redução dos volumes de meios de cultura são suficientes para o tecido, o que permite um uso eficiente da CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Wiretrop II agulhas capilares </td><td> Drummond Científico </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Adesivos Ellsworth </td><td> # 184 SIL ELAST kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspirador conjunto de tubos </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Filtro descartável </td><td> Venturi ou farmácia local </td><td> não disponível </td><td> Filtro de cigarro normal </td></tr><tr><td> Faca Roundstock oftálmico (15 faca facada grau) </td><td> Precision mundo Instruments, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35 milímetros de vidro prato de cultura fundo </td><td> MatTek Corp </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platina-irídio fio </td><td> Tritech Pesquisa </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Membrana Track-Etch </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Iridectomia </td><td> Belas Science Tools </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

A CSF é um fluido complexo, com uma proteoma dinamicamente variáveis ​​ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, a CSF nascente diferencia do líquido amniótico no fechamento do tubo neural anterior. Volume de LCR, então aumenta ao longo do dia subsequentes como as células progenitoras gliais que revestem os ventrículos e plexo coróide gerar CSF. Os contactos embrionárias CSF a superfície apical ventricular, das células estaminais neurais do cérebro e da medula espinal em desenvolvimento. CSF fornece pressão de fluido crucial para a expansão do cérebro em desenvolvimento e distribui crescimento importante promover factores de células progenitoras neurais de uma forma temporal específico. Para investigar a função do LCR, é importante isolar amostras puras de CSF embrionário sem contaminação a partir do sangue ou do tecido em desenvolvimento telencefálica. Aqui, nós descrevemos uma técnica para isolar amostras relativamente puras de ventricular embrionário CSF ​​que podem ser usados ​​parauma vasta gama de ensaios experimentais, incluindo a espectrometria de massa, electroforese de proteínas, e de células e cultura de explantes primários. Demonstramos como dissecar e cultura explantes corticais em membranas porosas de policarbonato para crescer desenvolvimento do tecido cortical com volumes reduzidos de mídia ou CSF. Com este método, as experiências podem ser realizadas utilizando CSF ​​a partir de diferentes idades ou condições para investigar a actividade biológica do proteoma CSF nas células-alvo.

A coleção CSF ​​deve produzir um líquido claro e transparente. Não deve haver qualquer evidência de contaminação do sangue, como foi demonstrado por um fluido tingido vermelho ou amarelo no aspirado e no tubo de Eppendorf. Também deve haver nenhuma evidência de tecido aspirado e no tubo de Eppendorf. Quando o CSF ​​é centrifugado, pode-se igualmente avaliar a CSF microscopicamente para assegurar que não existe contaminação. Se houver sinais de contaminação, o QCA deve ser descartada. De uma ninhad...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de cultura ou do LCR.

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Neurociência

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...