Name: isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00
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Estamos muy agradecidos por el apoyo del NIH (R00 NS072192 números Premio a MKL, HD029178 a AS.L., y 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL ha recibido del Hospital Infantil de Boston Career Fellowship Desarrollo de la Confraternidad / Harvard Medical School Shore y un compañero de la Alfred P. Sloan Foundation. CAW es un investigador del Howard Hughes Medical Institute.

1. Aislamiento de embriones / Preparación Esta técnica se puede utilizar para el ratón o la rata. En este protocolo se demuestra la técnica de recolección de LCR y disección cerebral cortical explantes con cerebro de ratón embrionario. Vamos a comentar sobre las diferencias importantes en comparación con las ratas ratones que existen dentro de las técnicas generales. Para el sistema de estadificación edad embrionaria, E1 es clasificado como el día de la clavija de ratas, y E0.5 se c...

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	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li><li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid.">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li><li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure.">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li><li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface.">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li><li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li><li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

El método descrito para la recolección de líquido cefalorraquídeo ventricular ha dado muestras relativamente puras de CSF embrionario con la composición de proteína estable y la actividad consistente en una serie de ensayos celulares 9. Con una técnica buena colección y tamaño de la camada de diez ratones E14.5, se puede esperar para cobrar 10-15 l de LCR y de una camada de ratas E16, se puede esperar para recoger alrededor de 50-90 l de LCR. Esta técnica minimiza la contaminación de recogida de la...

El líquido cefalorraquídeo es un líquido complejo que baña el neuroepitelio desarrollo 1-6 y ofrece 7 Presión esencial y la promoción del crecimiento claves para el desarrollo del cerebro 8-12. Para estudiar el CSF en el curso del desarrollo del cerebro, hemos desarrollado técnicas para aislar CSF del ventrículo desde el desarrollo de embriones de rata o ratón durante varias etapas de desarrollo 6,9. Los métodos anteriores de aislamiento incluyó el uso de un cristal de micro-aguja y aislar el CSF utilizando un micro-inyector de 1,2. Nuestro método utiliza un vaso capilar micro-pipeta cuya punta se ha tirado para crear un punto de penetración en el tejido ultrafino mejorada. El cristal de micro-pipeta capilar está conectado a un aspirador de modo que para obtener el LCR ventricular se puede controlar con cambios suaves en la presión. Para investigar la influencia de células madre de señales de LCR, se diseccionan cerebrales corticales explantes, colocarlos en las membranas de policarbonato y flotar sobre ellos cu apropiadaslture medio suplementado con muestras de LCR 9. Con esta técnica, los volúmenes reducidos de medios son suficientes para el cultivo de tejidos, lo que permite un uso eficiente de los CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Wiretrop II agujas capilares </td><td> Drummond Scientific </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> # 184 SIL ELAST kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspirador conjunto del tubo </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Filtro desechable </td><td> Venturi o farmacia local </td><td> no disponible </td><td> Filtro de cigarrillo estándar </td></tr><tr><td> Roundstock cuchillo oftálmico (15 cuchillo puñalada grado) </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm plato de cristal cultura fondo </td><td> MatTek Corp. </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platino-iridio de alambre </td><td> Tritech Investigación </td><td> # PT-9010-010-3 pies </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track Etch-membrana </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras iridectomía </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

El CSF es un fluido complejo con un proteoma que varía dinámicamente durante todo el desarrollo y en la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la CSF naciente diferencia del líquido amniótico tras el cierre del tubo neural anterior. El volumen de LCR aumenta entonces en los días subsecuentes como las células progenitoras neuroepiteliales que recubren los ventrículos y el plexo coroideo generan LCR. Los embriones de contactos de LCR la apical ventricular superficie de las células madre neurales del cerebro en desarrollo y la médula espinal. CSF proporciona presión de fluido crucial para la expansión del cerebro en desarrollo y distribuye crecimiento importante promoción de los factores de las células progenitoras neurales de una manera temporal específica. Para investigar la función de los CSF, es importante aislar muestras puras de embrionario CSF ​​sin contaminación de la sangre o del tejido en desarrollo telencephalic. Aquí se describe una técnica para aislar muestras relativamente puras de CSF del ventrículo embrionario que se pueden utilizar parauna amplia gama de ensayos experimentales, incluyendo la espectrometría de masas, electroforesis de proteínas, y cultivo de células y explante primario. Se demuestra cómo diseccionar y cultura explantes corticales en membranas porosas de policarbonato con el fin de crecer tejido en desarrollo cortical con volúmenes reducidos de los medios de comunicación o CSF. Con este método, los experimentos se pueden realizar utilizando CSF ​​de diferentes edades o condiciones para investigar la actividad biológica de la proteoma CSF en las células diana.

La recolección de LCR debe producir un líquido claro y transparente. No debería haber ninguna evidencia de contaminación de la sangre, como se demuestra por un fluido teñido de color rojo o amarillo en el aspirado y en el tubo Eppendorf. También debe haber evidencia de tejidos en el aspirado y el tubo Eppendorf. Cuando el CSF se centrifuga, se puede también evaluar el CSF microscópicamente para garantizar que no hay contaminación. Si hay signos de contaminación, el LCR debe ser desechada. De una camada ratón ...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de cultivo o LCR.

Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Investigación

Neurociencias

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Efectos de Neurotrauma inducido ráfaga en roedor a presión media de las arterias cerebrales

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...