Name: in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio
Uploaded: 2013-08-24T14:00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio at JoVE.com

Vi anerkender støtte fra en Duke University Dean Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) stipendium 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) tilskud R01-EY021872 fra National Eye Institute (EED) R01HD04260 fra National Institute of Child Health og Udvikling (NK), R01DK072301 og R01DK075972 fra National Institute of Diabetes Digestive og nyresygdomme (NK), og Den Europæiske Union (Finansieret af EU 7 th FP under GA nr. 241.955, projekt SYSCILIA,. EED, NK) NK er en Distinguished Jean og George W. Brumley Professor.

1.. Bioinformatik Analysis <ol><li> Undersøg, om det humane gen af ​​interesse har en zebrafisk ortolog, og hvis ja, hvor mange kopier. Vi anbefaler gensidig BLAST ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ) i det humane protein mod zebrafisk genomet og efterfølgende BLAST af de bedste zebrafisk ramt mod den humane genom. Ægte orthologer vil være den bedste hit i hvert enkelt tilfælde. </li><li> Bestemme størrelsen af ​​den åbne læseramme (ORF) af det humane gen. Hvis længere end 6 kb, er denne model umedgørlig i øjeblikket på grund af begrænsninger af høj kvalitet in vitro transkription af lange skabeloner. </li><li> Opnå eller frembringe en konstruktion indeholdende det humane ORF i pCS2 + vektorrygraden (eller tilsvarende vektor med et 5 &#39;SP6 transkription websted og 3&#39; polyA signal). </li><li> Design en MO til at blokere splejsning eller oversættelse af den målrettede zebrafisk genet. Hvis flere kopier eksisterer i zebrafisk genom there er to muligheder: a) udformning af yderligere MOs, eller b) identifikation af en splejsning site fuldt bevaret mellem kopier, mod hvilken en enkelt MO kan være effektiv. Nogle offentliggjorte MO sekvenser er tilgængelige på <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a> . </li></ol> 2.. Expression Analyse i Udvikling Zebrafish Embryo <ol><li> Bestem hvis zebrafisk ortholog er udtrykt i en Spatiotemporal kontekst er relevant for fænotypisk udlæsning. Hvis der ikke udtryk data er tilgængelige for genet af interesse, foretage omvendt transkription (RT)-PCR ved hjælp af cDNA fra hele zebrafisk embryoner eller in situ hybridisering. (Se 2,3). </li></ol> 3.. Mutagenese <ol><li> Design mutagenese primere 25-45 baser i længden, med den ønskede mutation i midten. Primeren smeltepunktet skal være større end eller lig med 78 ° C. Design en frem og tilbage mutageneseprimer at anneale til modsattestrenge af plasmidet. </li><li> Anskaf primere til sekvens bekræftelse af ORF post-mutagenese, disse skal flise tværs ~ 300 basepar sektioner for at dække hele ORF. </li><li> Saml mutagenese reaktion med en high-fidelity-polymerase og cyklus som følger (1: 95 ° C 30 sek, 2: 95 ° C 30 sek, 3: 55 ° C 1 min, 4: 68 ° C 6 min, 5: Go til 2 18x, 6: 4 ° C for evigt, 7: slutningen). </li><li> Tilsæt 1 pi Dpnl restriktionsendonuklease pr reaktion at fjerne dæmning methylerede skabelon, inkuber ved 37 ° C i 2 timer. </li><li> Transform 2 pi mutagenese reaktion i 20 ul kompetente celler i overensstemmelse med standardprotokoller. </li><li> Pick 3-4 kolonier og podes 5 ml LB-medier indeholdende passende antibiotika. Ryste ved 37 ° C natten over ved 225 rpm. </li><li> Miniprep DNA og bestemme koncentrationen. </li><li> Sekvens mutationsstedet at bekræfte tilstedeværelsen af ​​mutationen af ​​interesse. </li><li> Sekvens hele ORF at bekræfte sekvens integritet. </li></ol> 4.. In vitro mRNA transskription <ol><li> Ved hjælp af en lineariseret pCS2 + skabelon udjævnede mRNA ved hjælp af mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) genererer. Vi anbefaler at bruge halvdelen af ​​de reaktionskomponent mængder. </li><li> Oprense RNA-prøve med LiCI udfældning eller phenol chloroform som beskrevet i kittet anvisninger. </li><li> Bestemme koncentrationen af ​​mRNA under anvendelse absorbans sikre integriteten af ​​mRNA&#39;en ved hjælp af gelelektroforese, og opbevare prøven i tre eller flere alikvoter ved -80 ° C, indtil den er klar til brug. Vi anbefaler ikke flere fryse-tø cykler af mRNA portioner. </li></ol> 5.. In vivo Assay af Variant tab af funktion <ol><li> Opnå zebrafisk embryoner fra naturlige zebrafisk parringer, og vedligeholde dem ved 28 ° C i embryo vand i 6 eller 10 cm retter. </li><li> Gennemføre en morpholino dosisreaktionskurve at evaluere fænotype specificitet, MO effektivitet og MO toksicitet. Indsprøjte en dosis kurve påmindst tre forskellige koncentrationer mellem 1-10 ng MO i 50-100 (1-4 celle stadiet) zebrafisk embryoner / batch. Effektive MOs bør give anledning til dosis-afhængige stigninger i andelen af ​​påvirkede fostre i en batch. </li><li> Fænotype embryoer på passende udviklingsstadiet baseret på ekspression af målrettet zebrafisk genet af interesse og stadium, hvor et relevant fænotype vil blive observeret. Dette kan enten være kvantitative (såsom en måling mellem anatomiske strukturer) eller kvalitative (baseret på standardiserede fænotypiske kriterier). For alle injektioner scorede&gt; 24 hpf: embryoer bør behandles med PTU (0,003% 1-phenyl-2-thiourinstof i embryo medier) ved 24 HPF til maksimal reduktion af melanocyte dannelse. </li><li> For splejse-blokerende Mos, test MO effektivitet ved at ekstrahere total RNA fra hele embryo lysater på det tidspunkt af fænotypisk scoring, generere cDNA og udføre RT-PCR af målgenet under anvendelse af primere som flankerer MO målstedet. </li><li> For at verificere undertrykkelse effekiency af et tb-MO, høst hele embryo proteinlysater og adfærd immunoblotning at sammenligne niveauet af den målrettede protein versus kontrol. Men denne tilgang er ikke modtagelig for alle target gener, fordi der er begrænset krydsreaktivitet for mange kommercielle antistoffer til zebrafisk proteiner. To indirekte metoder til at vise MO specificitet, omfatter: a) viser, at der er en dosisafhængig virkning på fænotype, og b) viser, at samtidig injektion af vildtype mRNA med tb-MO redder fænotype effektivt. Af disse grunde anbefaler vi en splejsning blocker når det er muligt, fordi effektivitet kan overvåges direkte. </li><li> Hvis en fænotype observeret fortsætte til trin 5,7, hvis ingen fænotype observeret fortsætte til trin 6.1. </li><li> For kvalitative fænotyper, vælge et MO dosis, hvor 50-75% af embryoner er berørt, for kvantitative fænotyper, en MO dosis, hvor den fænotypiske foranstaltning er væsentlig forskellig fra vildtype (p &lt;0,001) vælger. Tilføre nye partier af zebrafisk embryos (1-4 celle stadiet, n = 50-100/batch) med en cocktail indeholdende &quot;-assay&quot; dosis af MO og en dosis kurve af humant WT mRNA (spænder fra 10 til 200 pg mRNA, disse doser sikre væsentlig overekspression ovenfor grundlinjen i en enkelt udskrift, svarende 0,25-0,5% af den samlede polyA mRNA i en zebrafisk embryo). 4. </li><li> Gennemføre maskeret scoring af injektion partier, vælger WT mRNA dosis sammen med de mest betydningsfulde redning i forhold til MO alene dette er &quot;analysen&quot; dosis af mRNA. </li><li> Tilføre nye batches (1-4 celle stadiet, n = 50-100/batch) med assay dosis af MO og assay dosis af mutant menneskelige mRNA. Fænotype embryoer på et passende tidspunkt og sammenlign resultaterne til WT human mRNA redning ved hjælp af en passende statistisk test (t-test eller chi-squared). Se figur 1 for resultater og fortsætte til trin 7.. Injicer assay doser af WT og mutant mRNA alene at kontrollere for mRNA toksiske virkninger. </li></ol> 6.. In vivo Assay af Variant Dominant Negativ eller Gevinst på Funktion Effekter <ol><li> Hvis der ikke tab af funktion fænotype observeret (trin 5.5), eller hvis mutant mRNA giver anledning til fænotyper ikke signifikant forskellig fra MO alene (trin 5.7), indsprøjte en dosis kurve spænder fra 10 til 200 pg WT humant mRNA (vi anbefaler 25, 50 og 100 pg som en indledende test) i embryo partier (1-4 cell fase; 50-100 embryoner / batch). </li><li> På et passende tidspunkt (se 5.3 ovenfor), foretage fænotypisk scoring, og bestemme den højeste dosis, hvor der ikke er en statistisk signifikant antallet af døde og / eller berørte embryoner i sammenligning med ikke-injicerede kontroller. Dette er &quot;analysen&quot; dosis. </li><li> Injicere assay dosis af mutant humant mRNA (1-4 celle stadiet; 50-100 embryoner / batch). Fænotype embryoner og sammenlign resultaterne til scoring fra analysen dosis af WT humant mRNA injektion eller assayet MO koncentrationen. Se figur 1 for resultater. </li><li> Hvis resultaterne er til at skelne fra MO, titreres human mutant mRNA med WT mRNAog sammenligne den menneskelige WT og mutant mRNA injektioner. Forbedring af fænotyper med mutant plus WT mRNA-indsprøjtede batches viser en dominant negativ. Ingen forbedring indikerer en gevinst på funktion. </li></ol> 7.. Gengiv in vivo testresultater <ol><li> Gentag in vivo-analyser minimum tre gange. </li></ol> 8.. Integrer Zebrafisk patogenicitet in vivo data med andre former for evidens <ol><li> Sammenlign patogenicitet data fra zebrafisk eksperimenter: genetiske data inden for en stamtavle (hvis relevant), kontrol populationsfrekvens data, in vitro studier (cellebaserede assays af protein stabilitet, cellulær lokalisering, signalering output eller enzymatisk aktivitet). </li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

De her beskrevne metoder repræsenterer en generel protokol for analysen af nonsynonymous ændringer i forbindelse med en række humane genetiske sygdomsfænotyper (tabel 2, figur 3). Vores metoder har vist sig nyttig til at vurdere de potentielle konsekvenser af variation på sygdomsfænotyper, og for at hjælpe dissekere sygdomsmekanismer (såsom bidrag dominerende negative mutationer til Bardet-Biedl syndrom, en primært autosomal recessiv sygdom 17). Til dato, gennem udvikling af den forelagte beslutning træet har vi modelleret til en rimelig pris og tid på over 200 gener kausalt forbundet med genetiske sygdomme, til et overskud af 1.000 alleler. Selvom det ikke er diskuteret i detaljer her, har vi også vist, at disse metoder er hensigtsmæssige til at modellere andre typer af genetiske læsioner, såsom kopi nummer varianter (CNVs), samt og genetiske interaktioner. Analyser af sådanne begivenheder er uden for rammerne afden foreliggende fremgangsmåde beskrivelse, selvom de fundamentalt afhængige af samme princip systematisk test af kandidatgener (herunder par af gener injiceret samtidigt) for at bestemme induktion eller forværring af klinisk relevante fænotyper. For eksempel kan at belyse, hvilke af de 29 gener i 16p11.2 CNV være relevante for den observerede mikrocephali observeret hos patienter med gentagelser af et 660 kb genomisk segment, mRNA&#39;er svarende til hver af de 29 gener i segmentet blev injiceret og hoved størrelse målinger blev foretaget på 2 dpf og 5 dpf, afslører et stort bidrag af et enkelt afskrift, KCTD13. 21. Derudover har vi brugt denne model til assay genetiske interaktioner af genomiske læsioner hos patienter med både Bardet-Biedl syndrom og Hirschsprung sygdom. 22. ved sammenligning af MO undertrykkelse af de kausale gener af de to kliniske identiteter separat og samtidigt, var vi i stand til at identificere den resulterende fænotype som being en synergistisk vekselvirkning snarere end blot additiv sværhedsgrad. Trods have etableret høj følsomhed (98%) og specificitet (&gt; 82%) for varianter bidrager til ciliopathies 17, har vi ikke endnu har tilstrækkelige data til at afgøre, om disse er generaliserbare til alle fænotypiske readouts i zebrafisk modeller. For at gøre dette, et stort antal alleler, forudsagde genetisk at være enten godartet eller patogene, skal testes inden hver fænotypisk kategori. Dette vil være særlig vigtigt for gennemførelsen af ​​sådanne analyser i kliniske omgivelser, kan hvor funktionel fortolkning af VUSS informere diagnosticering og behandling kun, hvis en robust forståelse af falsk positive og falsk negative kan ledsage levering af sådanne resultater til læger og patienter. Ikke desto mindre kan disse metoder bidrage væsentligt mod en bedre forståelse af landskabet i menneskets genetiske sygdomme. Vi forventer, at disse modeller ikke kun vil tjene som en grundvoldeling for bedre tolkning af klinisk genetisk information, men vil også blive ansat som nyttige modeller til at gennemføre terapeutiske skærme. In vivo data kan også sammenlignes med i silico beregningsmæssige forudsigelser fra kilder såsom PolyPhen 23 SIFT 24 SNPs &amp; GO 25 eller MutPred 26 at vise konkordans. Bemærk, at i en tidligere undersøgelse af forudsigelse databaser SNPs &amp; GO og MutPred fandtes at være den mest præcise, med nøjagtigheder nåede kun 0,82 og 0,81, hhv. 27. Selvom vi har skitseret robustheden af disse metoder til en delmængde af pædiatriske anatomiske defekter (tabel 2, figur 3), visse fænotyper er mindre medgørlig ved disse fremgangsmåder. Nogle undtagelser trods, er der tre primære klasser af lidelser ikke gøres til genstand for vores protokol. Voksen-debut lidelser (såsom Parkinsons sygdom) er en udfordring at modellere i et embryo system. Langsom progression degenerative fænotyper (såsom frontotemporal demens) kan kræve mere tid end de syv dpf vindue MO aktivitet at producere en fænotype. Andre gen knockdown teknologier såsom RNAi og siRNA er tilgængelige til at forstyrre eller forringe genet mål, men det har vist sig, at ingen er så specifik, stabil, ikke-toksisk, eller langvarig da MOS 28, hvilket også vil begrænse den tidsramme for fænotypebestemmelse. Tredje, nogle hvirveldyr strukturer, såsom pattedyr lunge, ikke har en tilstrækkelig ortologe struktur i zebrafisk embryoet. Vi har også givet en foreslået beredskabsplan for efterforskning af de tilfælde, hvor WT human mRNA injektion medfører en fænotype, selvom vi advare dette er en usædvanlig og uønsket situation. Visse sygdomsfænotyper kan så kræve en større grad af abstraktion og rugemødre. Det er muligt, at genfunktion har afveget tilstrækkeligt til at svække fænotypisk lighed mellem model og true fænotype, eller at zebrafisk fysiologi sagens natur komplicerer virkningerne af den inducerede sygdom. I sådanne tilfælde foreslår vi yderligere dissektion af den producerede fænotype før afskedigelse. Vi har produceret nogle vellykkede eksempler på, hvilke problematiske fænotyper for dette assay er blevet modelleret i zebrafisk embryoner. For eksempel mutationer i TCF8 blev et gen forbundet med Fuchs hornhinde dystrofi (FCD), analyseret ved hjælp af vores protokol ved at bruge gastrulation defekter som surrogat fænotypisk udlæsning baseret på de kendte roller denne udskrift i den tidlige udviklingsfase. 29. I andre tilfælde, som f.eks som voksen-debut muskelsvind forårsaget af mutationer i DNAJB6 var vi i stand til at generere myofiber fænotyper i 5dpf embryoner trods det faktum, at mennesker er berøvet mærkbar muskel patologi i deres første tre til fire årtiers livet. 19. Ud over de forbigående mutant modeller, der præsenteres her, andre har også taget Advantage af denne forbigående system modellere human sygdom i en række af kroppens systemer. I et eksempel blev retinitis pigmentosa modelleret i zebrafisk ved knockdown af genet RP2, hvilket resulterer i retinal celledød og nedsat retinal laminering. Rescue med humant vildtype-mRNA resulterede i udviklingen af alle tre lag af retinal laminering, mens fire ud af fem mutant mRNA&#39;er undladt at redde. 30. Selv om denne model af en human sensorisk lidelse er baseret på en morfologisk fænotype, er det også muligt at assay respons på stimuli, såsom akustisk forskrækkelse eller præimpuls hæmning. 47. For nylig blev en zebrafisk model, der anvendes til at undersøge Alzheimers sygdom patogenese gennem amyloidprecursorprotein. 31 Forfatterne viste, at genet knockdown forårsagede forringet axonal udvækst af motoriske neuroner, som kunne reddes med human mRNA. Denne model har vist sig at være særligt informativ, da musemodeller kun vise subtil phenotypes (single knockdown) eller postnatal embryoletaliteten (dobbelt knockdown). Evnen til at vurdere de zebrafisk embryoner in vivo hele udviklingen hjulpet at skelne patogene virkning af reduceret amyloidprecursorprotein, samt forudsat direkte bevis for, at proteinet kræver både et ekstracellulært og intracellulære domæne for korrekt funktion. Andre bemærkelsesværdige modeller omfatter, at yderligere muskeldystrofier 32, Diamond Blackfan anæmi 33, Axenfeld-Reiger syndrom (okular og kraniofaciale udvikling) 34, inflammatorisk tarmsygdom 35 (antibakteriel aktivitet), Parkinsons sygdom 36 (neuron og bevægelse tab), og beslaglæggelse 37. (hydrocephalus og hyperaktivitet). Mere almindeligt er mutant zebrafisk linjer, der er blevet vist også at rekapitulere en menneskelig sygdom fænotype. Bedømt i 1,38, modeller omfatter leukæmi, melanom, udvidede kardiomyopati, Duchenne muskeldystrofi,og mange andre.

Den funktionelle fortolkning af genetisk information og tildeling af den prædiktive kliniske værdi til en genotype udgør et stort problem i medicinske genetik og bliver stadig mere gribende med den accelererende tekniske og økonomiske gennemførlighed af genome-wide sekventering. Derfor er det nødvendigt at udvikle og implementere nye paradigmer at teste patogenicitet af varianter af ukendt signifikans (VUS) opdaget i patienter. Disse assays skal derefter være nøjagtige, tid-og omkostningseffektiv, og havnen potentiale til at katalysere en overgang til klinisk anvendelighed. Mens musen har traditionelt været det foretrukne værktøj inden for human sygdom modellering, er zebrafisk fremstår som en videnskabeligt og økonomisk favorable surrogat. I modsætning til mus giver zebrafisk biologi let og rettidig adgang til alle udviklingsstadier, hjulpet af optisk klarhed af embryoner, som giver mulighed for real-time scanning i udviklingslandene patologier. <sup&gt; 1 Den relativt nylige generation af mutant zebrafisk linjer har givet yderligere test og modellering muligheder, ansat af mange i funktionelle undersøgelser, men denne teknologi fortsætter med at være begrænset (revideret i 1,38). Ikke alene er genetiske mutanter med knock-ins af specifikke mutationer besværlige at nå, er de heller ikke gøres til genstand for mellem-eller høj-throughput analyse til afprøvning af en række mutationer i et enkelt gen. Vigtigere, kan en enkelt række prøver give oplysninger ikke kun for den patogene potentiale af alleler, men også for retningen af virkning på celleniveau (f.eks tab af funktion vs gevinst funktion), som er afgørende for at informere arvegang i familier, små menneskelige stamtavler især når havnen begrænsede oplysninger om tilstanden af ​​genetiske transmission. For yderligere sammenligning af brugen af tilgængelige mus og zebrafisk modeller se tabel 1. Vi bemærker også, at denre er iboende begrænsninger for zebrafisk model system. Selvom D. rerio have hurtig indledende udvikling af organsystemer, seksuel modenhed kræver ca tre måneder. På grund af dette, er prænatal og pædiatriske-debut lidelser mest modtagelig for denne forbigående ekspression model. Mens ideel til udførelse store kemiske sammensatte skærme, er brugen af ​​genetiske mutanter ikke muligt for systematisk test af tusindvis af nonsynonymous varianter, der bidrager til, og fortsætte med at blive opdaget i pædiatriske lidelser. De komplementering test beskrives her drage fordel af denne eksperimentelle medgørlighed, høj grad af homologi, og bevarelse af funktion mellem humane og zebrafisk proteiner, især tilfældet for molekyler, der er nødvendige for konserverede udviklingsprocesser. Figur 1 skitserer afprøvning og identifikation strategi til forskellige allel effekter. Begge tab af funktion (LOF) og dominerende assays kan udføres. For LOF begynder eksperimentere med undertrykkelse af genet af interesse med en morpholino knockdown og analysering for fænotyper der kan være relevante for den kliniske fænotype under efterforskning. Undertrykkelse kan opnås enten ved at blokere translation ved at målrette en MO på eller nær translationsstartsted af zebrafisk locus (oversættelse blocker morpholino, tbMO), eller ved at interferere med splejsning ved at placere en MO på en splejsningsforbindelsen, typisk fremkalde enten optagelse af et intron eller afvigende exon skipping (splejsning blokering morpholino, sbMO). Efterfølgende udjævnede mRNA fra ortologe menneskelige udskrift introduceret og kvantificerbare redning af fænotype måles. Når analysen er etableret, kan kandidat mutationer i humane budskab indføres og analyseret for deres evne til at redde MO-induceret fænotype på samme effektivitet som WT menneskelige mRNA. Omvendt for kandidat dominante alleler, human mRNA (men ikke MO) er introduktioned en forventning om, at WT menneskelige mRNA ikke vil groft påvirke zebrafisk anatomi og fysiologi, mens indførelsen af ​​test mutationer, der har en dominerende effekt vil fremkalde fænotyper svarende til dem observeret i humane kliniske tilstand. Dette eksperiment kan være finkornet yderligere at dissekere om den dominerende effekt forekommer ved en forstærkning af funktion (GOF) eller en dominant negativ mekanisme ved at blande WT og mutant menneskelig mRNA, for GOF begivenheder, tilsætning af WT humant mRNA forventes at være irrelevante, bør der for dominant-negative alleler, blanding af WT og mutant mRNA ændre sværhedsgraden af ​​fænotype induceret af mutant besked. I alle tilfælde anbefaler vi, at alle kombinationer af injektioner (MO med WT human mRNA vs morpholino med mutant human mRNA etc. skal udføres, helst inden for samme kobling af embryoner (se figur 1) Fortolkning er som følger.: For LOF tests: <ul><li> Hvis knockdownfrembringer en fænotype, der kan reddes ækvivalent med mutant og WT mRNA allelen er sandsynligvis godartet. </li><li> Hvis mutant redning af knockdown fænotype er sammenfaldende knockdown fænotype selv, allelen er en sandsynlig funktionel null. Forsøget kan ikke diskriminere mellem sande nuller (ingen funktionel protein) og ultralow protein aktivitetsniveauer, der ikke har redning kapacitet. </li><li> Hvis mutant redning af knockdown fænotype er statistisk bedre end MO, men dårligere end WT, allelen er sandsynligvis en hypomorph som dette resultat viser delvis tab af funktion. </li></ul> For dominerende tests: <ul><li> Hvis der ikke er knockdown fænotype, men injektion af WT mRNA frembringer en fænotype, skal en beredskabsplan anvendes, hvis forsøget er at fortsætte (se nedenfor). </li><li> Hvis der ikke er knockdown fænotype og injektion af WT mRNA producerer ingen fænotype eksperimentet fortsætter som sædvanlig. </li><li> Hvis injektionaf mutant mRNA svarer til at af vildtype mRNA, kan allel være enten godartet eller tab af funktion, eller assayet kan være mislykket. Det kræver yderligere eksperimenter for at skelne mellem disse muligheder. </li><li> Hvis injektion af mutant mRNA kan skelnes fra MO knockdown, er funktionen af ​​genproduktet sandsynligvis ændres på en eller anden måde. At skelne ændringen i funktion, skal en titrering af mutant mRNA med vildtype-mRNA udføres. </li><li> Hvis resultatet af denne titrering er sammenfaldende med vildtype-mRNA alene, er det blevet vist, at mutant protein produkt bruger vildtype-protein som et substrat, som dens effekt varieres med mængden af ​​titreringen. Dette indikerer en dominant negativ fænotype. </li><li> Hvis resultatet af denne titrering er umulige at skelne mutant mRNA alene, er det blevet vist, at mutant protein produkt ikke længere har den samme funktion som vild-typen, og er således ikke påvirket af mængden af ​​vildtype-protein-produkt præsendt. Dette viser, at allelen er sandsynligvis forstærkning af funktion. </li></ul> Beredskabsplan: <ul><li> Hvis der ikke fænotype præsenterer fra MO knockdown, men gør til stede med WT mRNA, kan yderligere eksperimenter opstå, selv om vi understrege, at denne situation ikke er ideel. WT menneskelig mRNA skal titreres for at minimere fænotype, og kan også anvendes som et nyt sæt punkt. Yderligere injektion af WT og mutant menneskelig mRNA kan vurderes baseret på redning evne mutanten. </li></ul>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S, M0530L </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DpnI restriction endonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L, R0176S </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258-012 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Big Dye Terminator</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340, AM1344, AM1348</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Morpholino</td>
			<td>Gene-Tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >1-phenyl-2-thiourea (PTU) </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Prepare as 0.003% PTU in embryo media </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148 </td>
			<td>For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>N/A </td>
			<td>For anesthetization and euthanasia </td>
		 </tr>
 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Any equivalent thermal cycler</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nano Drop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMZ 745T Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AZ100 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS Fi1 Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For color/fluorescent imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS QiMC Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For black/white imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Advanced Resarch 3.2 Imaging Software</td>
			<td>NIS- Elements</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio

Her præsenterer vi metoder til udvikling af assays til at forespørge potentielt klinisk signifikante nonsynonymous ændringer ved hjælp in vivo komplementering i zebrafisk. Zebrafisk (Danio rerio), er et nyttigt dyr system på grund af deres eksperimentelle sporbarhed, embryoner er gennemsigtige for at aktivere facile visning, undergår en hurtig udvikling ex vivo, og kan være genetisk manipuleret 1 Disse aspekter har tilladt for betydelige fremskridt i analysen af embryogenese. molekylære processer, og morfogenetiske signalering. Tilsammen fordelene ved denne hvirveldyr model gør zebrafisk særdeles modtagelig for modellering af udviklingsmæssige defekter i pædiatrisk sygdom og i nogle tilfælde, voksen-debut lidelser. Fordi zebrafisk genom er stærkt konserveret med som mennesker (~ 70% ortologe), er det muligt at rekapitulere humane sygdomstilstande i zebrafisk. Dette opnås enten ved injektion af mutant human MRNA at fremkalde dominant negativ eller gevinst på funktion alleler eller udnyttelse af morpholinogrupper (MO) antisenseoligonukleotider at undertrykke gener at efterligne tab af funktion varianter. Gennem komplementation af MO-inducerede fænotyper med udjævnede menneskelig mRNA muliggør vores tilgang fortolkningen af ​​den skadelige virkning af mutationer på human proteinsekvens baseret på evnen af ​​mutant mRNA at redde en målbar, fysiologisk relevant fænotype. Modellering af humane sygdoms alleler sker gennem mikroinjektion af zebrafisk embryoner med MO og / eller human mRNA på 1-4 celle stadiet, og fænotypebestemmelse op til syv dage efter befrugtning (dpf). Denne generelle strategi kan udvides til en bred vifte af sygdomsfænotyper, som demonstreret i følgende protokol. Vi præsenterer vores etablerede modeller for morfogenetisk signalering, craniofacial, hjerte-, kar-integritet, nyrefunktion og skeletmuskulatur uorden fænotyper, såvel som andre.

Recessive og Pseudorecessive Disorders Primære cilier er nær-allestedsnærværende strukturer på hvirveldyr krop plan, der spiller cellulær signalering roller i flere celleskæbner, herunder proliferation, polaritet, differentiering og væv vedligeholdelse. 5. dysfunktion af disse organeller fører til en bred vifte af humane genetiske lidelser benævnt samlet som ciliopathies. 6,7 En sådan klinisk enhed er Bardet-Biedl syndrom (BBS), et multisystemisk pædiatrisk lidelse karakteriseret ved retinal degeneration, fedme, hypogonadisme, polydaktyli og nyresvigt. 7. Udviklingen af in vivo-analyser af allel patogenicitet var nødvendig for BBS fordi a) det er en genetisk heterogen lidelse forårsaget af primært private nonsynonymous forandringer i mindst 17 ​​gener 7-10, og b) oligogenic arv i&gt; 25% af BBS familier, hvor tilstedeværelsen af heterozygote ændringer i en andenBBS genet (udover recessive primære kausale mutationer) kan modulere klinisk penetrans og ekspressivitet. Typisk sådanne eksterne alleler er nonsynonymous heterozygote ændringer, fra en genetisk synspunkt, uklare patogene potentiale, som nødvendiggør præcis fortolkning af deres biologiske effekt på protein funktion. 11-13 For at undersøge patogene potentiale af mutationer bidrager til mutational belastning i BBS, vi oprindeligt testet alle missense ændringer identificeret i BBS1 - BBS14. Både vi og andre har vist, at tab af basale kropsproteiner giver anledning til dysregulering af plane celle polaritet (PCP, ikke-kanoniske Wnt signalering). Manifesterer sig som konvergerende udvidelse defekter i midten somitic zebrafisk embryoner 14 Brug dette fysiologisk relevant fænotypisk udlæsning, vi har fundet, at undertrykkelsen af BBS gener resulterede i afkortede kroppens akser, bredere og tyndere somitter, og brede, bøjede notochords. 15 &lt;/ Sup&gt; (figur 2) MO-induceret suppression produceret gastrulation defekter, og co-injektion med humant mRNA reddet betydeligt (og reproducerbart) disse fænotyper som scoret af tre forskellige in vivo-metoder. Først blev embryoner scoret leve efter kvalitative fænotypiske kriterier (Normal, klasse I og klasse II, for detaljerede definitioner af fænotypiske klasser se 15). Derefter har vi kvantificeret cellemigrering under epiboly (et tidligt udviklingstrin karakteriseret ved udtynding og spredning af cellelag i blommen cellen 16) ved anvendelse af et fluorescein sporstof at visualisere migrerende celler. Endelig har vi målt somite trunk længde i ni somite embryoner i situ hybridiseret med en cocktail af krox20, Pax2 og MyoD riboprober, som blev flad monteret til morfologisk analyse. Denne metode er blevet anvendt til at teste på over 500 alleler i den ciliære mutationsbegivenhed rum. I énstudere alene, in vivo-test på&gt; 130 alleler produceret en række fænotypiske scores; som angivet af vores protokol (Figur 1) komplet redninger blev klassificeret som godartede (ikke signifikant forskellig fra WT redning), partiel redninger blev klassificeret som hypomorphs (væsentligt forbedret fra MO, men mere alvorlige end WT redning) blev manglende redning klassificeret som funktionelle nul (ikke signifikant forskellig fra MO), og fænotyper induceret af mutant mRNA alene sammenlignet med MO blev klassificeret som dominerende negativer. Vi har også evalueret sensitivitet og specificitet for in vivo komplementering assay zebrafisk. Specificitet blev bekræftet ved co-injektion af fælles SNPs (&gt; 5% mindre allel frekvens i raske kontrolpersoner populationer), og disse blev fundet at give godartede fænotyper i 14/17 testet (&gt; 82%), og følsomhed viste sig at være 98% som angivet af overensstemmelse mellem in vivo-data og genetiske argumenter tilstrækkelige to tilskriver en allel som kausal i en BBS stamtavle. 17. Desuden fænotypiske effekter observeret ved hjælp af tre in vivo foranstaltninger (levende scoring, epiboly sporing og ISH morphometrics), blev valideret in vitro ved hjælp af immunblotting og cellulære lokalisering studier. Mens fortolkningen af ​​disse resultater kræves forudgående kendskab mindst én mekanisme for sygdom patogenese, dette eksempel giver dokumentation for nytten og robusthed i vores protokol. Vi har siden bekræftet vores in vivo scoring med flere andre linjer af eksperimentelle bevismateriale i en fordomsfri mutational screening og funktionel analyse undersøgelse af TTC21B, et tilbageskridt intraflagellar transport protein. 18. Dominerende Disorders Limb girdle muskeldystrofier (LGMD) er en autosomal klasse af muskelsvind, der forårsager langsom fremadskridende muskelsvaghed i hofter og skuldre. Denne genetisk og migchanistically heterogen gruppe af sygdomme er forårsaget af både dominante og recessive mutationer på tværs af flere sarcolemmal, sarcomerisk, cytoplasmiske og nukleare proteiner. Baseret på præsentationen af kliniske fænotyper og beviser af muskel involvering fra magnetisk resonans, undersøgte vi årsag til en dominerende LGMD findes på finsk, USA, og italienske familier 19.. Sekventering af positionelle kandidater inden det kortlagte locus afslørede mutationer i DNAJB6, et gen, der koder et co-chaperone af HSP70 familie udtrykt som mindst to splejsningsisoformer (nuklear og cytoplasmatisk) i mennesker. For at få yderligere indsigt i DNAJB6 funktion og dets relevans for LGMD, undersøgte vi dens rolle i muskel integritet zebrafisk. RT-PCR af zebrafisk ortolog (dnajb6b) opdaget udtryk så tidligt som fem-somite etape, der blev efterfulgt af injektion af embryoner med en splejsning-blokering morpholino. Ved 48 timer efter befrugtning, viste maskeret scoring løsrives langsomfibre fra deres indsættelse point. Det særlige ved dette fænotype blev derefter testet med en anden ikke-overlappende MO og reddede efterfølgende med WT human DNAJB6 mRNA. At forespørge, hvordan tabet af DNAJB6 funktion fører til defekter i muskulære integritet, introducerede vi missense mutationer findes i patienter til menneskelige udskrifter af både isoformer og injiceres dem i zebrafisk embryoner. Mens injektion af WT humant mRNA produceret nogen mærkbar fænotype, disse ændringer phenocopied tabet af funktion virkninger af MO når manipuleret i det cytoplasmatiske, men ikke nuklear isoform. Dette blev efterfulgt af injektion af ækvimolære mængder af mutant og WT mRNA, som viste forøget sværhedsgrad af muskulære fænotype, hvilket tyder på en dominerende effekt. For at teste dette begreb blev yderligere injektioner udført med at ændre molforhold af mutant-og WT mRNA. Overens med forudsigelsen, et overskud af mutant mRNA sammenlignet med WT induceret letalitet i embryoner, mens enn overskud af WT produceret en progressivt redning. Dette blev efterfulgt af in vitro-eksperimenter til bestemmelse oligimerization egenskaber og mulige protein interaktion. Disse viste, at mutationerne forringe antiaggregation aktivitet cytoplasmatisk DNAJB6 og forstyrre omsætningen af ​​både mutant og WT, samt interagere med et andet molekyle, BAG3, som også er relevant for pathomechanism af LGMD, da LOF BAG3 forårsager en pædiatrisk form for muskelsvind 20.. Vi spurgte, om BAG3 kunne modulere fænotype induceret af mutant DNAJB6b i zebrafisk. Mens injektion af WT BAG3 alene gav ingen fænotype, coinjektion med DNAJB6 mutanter væsentligt forøget fænotypisk sværhedsgrad, hvilket tyder på, at BAG3 spiller en rolle ved mediering patogeniciteten af sådanne mutanter 19. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Transient zebrafisk Model </td> &lt;td&gt; Mutant zebrafisk Linje </td><td> Transgene mus Linje </td></tr><tr><td> Age of debut af menneskets fænotype under efterforskning </td><td><ul><li> prænatal </li><li> neonatal </li><li> pædiatrisk </li></ul></td><td><ul><li> prænatal </li><li> neonatal </li><li> pædiatrisk </li></ul></td><td><ul><li> prænatal </li><li> neonatal </li><li> pædiatrisk </li><li> voksen </li></ul></td></tr><tr><td> Muligt fænotyper </td><td><ul><li> craniofacial </li><li> muskuløs </li><li> signalering </li><li> cardiac </li><li> renal </li><li> vaskulær </li></ul></td><td><ul><li> craniofacial </li><li> muskuløs </li><li> signalering </li><li> cardiac </li><li> renal </li><li> vaskulær </li></ul></td><td><ul><li> craniofacial </li><li> muskuløs </li><li> signalering </li><li> cardiac </li><li> renal </li><li> vaskulær </li><li> sensorisk </li><li> skelet </li><li> visceral </li><li> adfærdsmæssige </li><li> respiratorisk </li><li> reproduktive </li><li> endocrinal </li><li> metaboliske </li></ul></td></tr><tr><td> Tid, indtil brug (fra fødslen) </td><td> 1-7 dage </td><td> &gt; 3 måneder </td><td> &gt; 6 måneder </td></tr><tr><td> Throughput </td><td> medium-høj </td><td> lav </td><td> lav </td></tr><tr><td> Fordele </td><td><ul><li> Mulighed for at teste specifikke mutationer </li><li> Evne til at generere knock-i modeller </li><li> Mulighed for at bruge morpholinogrupper knockdowns </li><li> Low-cost vedligeholdelse </li></ul></td><td><ul><li> Mindre eksperimenterende variabilitet </li></ul></td><td><ul><li> Tættere evolutionære forhold </li><li> Bevarelse af orgel strukturer </li><li> Evne til at gensats knock-in modeller </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Sammenligning af in vivo modeller. <img alt="Tabel 2" src="/files/ftp_upload/50338/50338table2.jpg" fo:content-width="7in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338table2highres.jpg"/> Tabel 2. Eksempler på in vivo modellering af menneskelige dysmorphologies. Forskellige fænotyper testet under den præsenterede protokol. En række fænotypiske udlæsninger og visualisering teknikker kan anvendes baseret på den type lidelse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50338/50338table2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større tabel.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig1.jpg" /> Figur 1.. In vivo funktionelle test af nonsynonymous varianter. En systematisk tilgang til funktionel test af alleeles af ukendt eller hypotese betydning. Gen knockdown via morpholino mikroinjektion efterfølges af en række af (co) injektioner af både WT og mutant menneskelig mRNA. Statistiske analyser af fænotypiske udfald informere allel patogenicitet og molekylære funktion. Kort fortalt for tab af funktionstest: Hvis knockdown producerer en fænotype, der kan reddes ækvivalent med mutant og WT mRNA, allelen er sandsynligt godartet (grøn boks). Hvis mutant redning af knockdown fænotype er sammenfaldende knockdown fænotype, allelen er en sandsynlig funktionel null (gul boks). Hvis mutant redning af knockdown fænotype er statistisk bedre end MO, men dårligere end WT, allelen er sandsynligvis en hypomorph (grøn boks) For dominante prøver:. Hvis injektion af mutant mRNA svarer til vildtype-mRNA , allelen kan være enten godartet eller tab af funktion eller analysen kan have undladt (grøn boks). Hvis injektion af mutant mRNA er uomgængeligt<html> tinguishable fra MO knockdown, er funktionen af ​​genproduktet sandsynligvis ændres på en eller anden måde. At skelne ændringen i funktion, titreres mutant mRNA med vildtype-mRNA. Hvis resultatet af denne titrering er sammenfaldende med vildtype-mRNA alene, mutantproteinet produkt bruger vildtype-protein som et substrat, hvilket indikerer en dominant negativ fænotype (blå boks). Hvis resultatet af denne titrering er umulige at skelne mutant mRNA alene, mutantproteinet produkt ikke længere har den samme funktion som vild-typen, og det er derfor sandsynligt en gevinst på funktion (blå boks). Hvis der ikke fænotype præsenterer fra MO knockdown, men gør stede med WT mRNA, kan yderligere eksperimenter opstå, bør WT menneskelig mRNA titreres for at minimere fænotype, og kan også anvendes som et nyt sæt punkt. Yderligere injektion af WT og mutant menneskelig mRNA kan vurderes baseret på redning evne af mutant (lyserød æske).ET = &quot;_blank&quot;&gt; Klik her for at se større figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig2.jpg" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338fig2highres.jpg"/> Figur 2. Kvantitativ og kvalitativ evaluering af MKS1 mutationer påvist hos mennesker. Udviklingsmæssige defekter i MKS1 morphant embryoner. Baseret på sværhedsgraden blev fænotyper klassificeres i tre grupper. Eksempler på hver klasse er vist (a), og deres forekomst i deres embryo kohorte (n = 100-160 embryoner) blev tabellagt (ikke vist). MO injicerede embryoner med klasse I fænotyper havde groft normal morfologi men var kortere, med overdreven fostervæv på blommen sammenlignet med kontrol injicerede embryoer på samme somitic alder (8-9 somitter). Klasse II morphants er decimeret, korte og havde dårligt udviklet hoved og hale strukturer og derudover manglede somitic definitionog symmetri. Klasse III embryoner blev alvorligt forsinket med dårligt udviklede og misdannet somitter, bølgede notochords og typisk overlevede ikke forbi den 10-somite scenen. Co-injektion af humant MKS1 mRNA reddet hver af disse mangler, der viser specificitet fænotyper til MKS1 undertrykkelse. In situ hybridisering af embryoner ved 11-somite etape (± 1 somite) farvet med krox20, Pax2 og MyoD riboprober (b, c ). Fænotyper blev kvantificeret ved målinger fra første til sidste mærkbar somite af hvert embryo (pile), kvantificeret i ca. Figur tilpasset med tilladelse fra 15.. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig3.jpg" fo:content-width="3.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338fig3highres.jpg"/> Figur 3. Eksempler på in vivo modellering af menneskelig dysmorphology. (A) Craniofacial dysmorphology. Kontrol mRNA injiceret embryo (venstre) og mutant injiceret embryo (til højre) farvet med alcianblåt ved 5 dpf. Mutants mRNA-indsprøjtede embryoner vise især små og misdannet hoved med en generel forvaltningsmæssigt bruskagtig craniofacial skelet omfattende spredte Branchialfødder buer og mangler eller misdannede strukturer. (B) Micro / macrocephaly. Kontrol uinjicerede embryo (venstre) og kctd13 MO-injicerede embryo (højre) ved 5 dpf. Morphants vise udvidelse af hovedet, som det ses af mellemrummet mellem øjnene. 21 (c) Nedsat vaskulær integritet. Kontrol injicerede embryon (øverst) og eng MO-injicerede embryoner (nederst) filmede med fluorescensmikroskopi ved 2 dpf i en fli1: eGFP transgen reporter linje. Morphants vise forringet spiring af intersegmental skibe og andre vaskulære strukturer. 41. (d) Altered hjerte looping. In situ hybridisering af uninjected vildtype embryoner (venstre) viser Spaw ekspression i den venstre laterale plade mesoderm, mens ccdc39 morphant embryoner viste bilateral (højre) eller, i de fleste tilfælde, påvises Spaw ekspression (ikke vist). 43 (e) Nyre cyster. Uinjicerede WT embryo (øverst) og ift80 morphant (nederst). Morphants viste store nyre cyster (pil), perikardial ødem (pilespids) og en krøllet hale. 44. (f) Nedsat glomerulær filtration. Fluorescerende visualisering af en kontrol injiceret embryo (øverst) og ift80 morphant (bund) 24 timer efter injektion af rhodamin dextran ind i hjertet. Fluorescens spredes i hele karsystemet, og er næsten helt evakueret af nyrerne set det fuldstændige fravær af fluorescens i kontrolgruppen. Den morphant viser vedvarende fluorescerende dextran, tyder reduceret glomerulær filtration. 46. (g) muskelsvind. WT DNAJB6 mRNA injicerede embryoner (øverst) viser normale langsomme myofibre spænder over somitter normalt mellem tilstødende myosepta som bestemt ved immunfarvning under anvendelse af anti-slow myosin-antistof. Mutant DNAJBb (nederst) viste delvis til fuldstændig adskillelse mellem myofibre fra myosepta i en eller flere somitter. 19 (h) somite vinkel. Forstørret levende laterale udsigt til kontrol uinjicerede (øverst) eller kif7 morphants (nederst) afbildet ved 30 HPF. Morphants vise unormalt formede somitter, der kan henføres til ektopisk Hedgehog signalering i zebrafisk myotome. 47. Alle tal er tilpasset med tilladelse.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio at JoVE.com

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio (Video) | JoVE

Her præsenterer vi en systematisk tilgang til udvikling af fysiologisk relevant, sensitiv og specifik<em&gt; In vivo</em&gt; Assays til tolkning variation i human patologi. Forbigående genetisk manipulation via mikroinjektion af WT og mutant menneskelige mRNA og morpholinogrupper (MO) antisenseoligonukleotider udnytte sporbarhed i udviklingslandene zebrafisk embryonet til hurtigt assay patogene mutationer, især, men ikke udelukkende, i forbindelse med humane udviklingsforstyrrelser.

In Vivo modellering af Morbid Human Genome hjælp Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling (Video) | JoVE

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio (Video) | JoVE

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells (Video) | JoVE

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio (Video) | JoVE

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction (Video) | JoVE

Regelmæssig pleje og vedligeholdelse af en zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay (Video) | JoVE

High throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energi Udgifter Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products (Video) | JoVE

Gap junktion intercellulær kommunikation: En funktionel biomarkør at vurdere negative virkninger af giftstoffer og toksiner, og Sundhedsmæssige fordele af Naturprodukter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse (Video) | JoVE

In vivo studie af human endotel-pericyt Interaktion Brug af Matrix Gel Plug Assay i Mus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability (Video) | JoVE

In Vitro og In Vivo tilgange til at bestemme Intestinal epitelcelle permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...