Name: assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Wij danken Leo Pallanck voor vlieg voorraden, Christine Sommers voor technische bijstand en Gerasimos P. Sykiotis voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door de NIH opleiding subsidie ​​T32CA009363 om MCB

1. Schrikreactie-geïnduceerde Negatieve geotaxis Assay <ol><li> Selecteer vliegen van het gewenste genotype, ze scheiden naar geslacht, willekeurig groeperen ze in cohorten van 20-30 dieren en draai ze in nieuwe voedingsmiddelen flacons om de 2-3 dagen; testen elke set van vliegen (dwz leeftijd gematchte cohorten, een cohort / genotype) minstens een keer per week. </li><li> Dertig minuten voor de negatieve geotaxis test, verdoven de vliegen met CO 2 en plaats ze in de pre-gelabelde plastic buizen ...

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

De assays beschreven een nuttige benadering van de rol van specifieke genen te bestuderen signaaltransductiewegen of kleine verbindingen in het onderhoud van DA neuronen bij veroudering en verschillende ziekte-gekoppelde genetische achtergronden (beoordeeld in 5). De schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag van Drosophila is uitgebreid gebruikt als een functionele uitlezing voor de functionaliteit van DA neuronen in verschillende genetische achtergronden, vooral ...

De specificiteit van de assays beschreven gebaseerd op het gebruik van een Gal4 vlieg lijn die de regulerende sequenties van de tyrosine hydroxylase gen specifieke expressie in dopaminerge neuronen 3 bereiken exploiteert. Tyrosine hydroxylase katalyseert de eerste en snelheidsbepalende stap in dopamine synthese. TH immunoreactiviteit in de volwassen vliegen hersenen overlapt met dat van dopamine, waardoor TH een goede kandidaat om DA neuronen in vivo (zie voorbeeld 6) te identificeren. Bovendien, het expressiepatroon van THGal4 is specifieker dan andere Gal4 lijnen zoals DdcGal4 die regulerende sequenties bevat van het dopa decarboxylase gen en rijdt transgene expressie niet alleen in DA neuronen, maar ook in serotonerge neuronen en gliacellen subsets van 3 . Feany en Bender (2000) voor het eerst waargenomen dat de pan-neuronale expressie van het Parkinson-gerelateerde menselijke α-synucleïne gen versnelt het progressief verlies van startle-geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag in Drosophila. We hebben soortgelijke resultaten met behulp van de DA-neuron specifieke THGal4 lijn naar de expressionof een α-synucleïne transgen 10 rijden geobserveerd en gebruikt dit functionele uitlezing aan de neuroprotectieve rol van de Nrf2 pathway in deze studie Drosophila model van PD 14. De specifieke assay beschreven wordt aangepast van 2 en 3. De Drosophila hersenen bevatten meer dan 100 DA neuronen, gerangschikt in ten minste 5 verschillende clusters (PPL1, PPL2, PAL, ppm1 / 2, ppm3) die volledige hersenen mounts kan worden gevisualiseerd door confocale microscopie (zie voorbeeld 11 en 7). Het is nog steeds controversieel of het aantal DA neuronen in de Drosophila hersenen afneemt met de leeftijd 9, 11, maar wordt leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie waargenomen bij vliegen wanneer PD-gebonden genen gemuteerd / overexpressie op menselijke ziekten modelleren5. De expressie van humaan α-synucleïne in DA neuronen heeft zo&#39;n effect en derhalve is gebruikt als een model voor PD. Hier beschrijven we een test voor DA neuronen tellen in hele brein mounts met TH als een cel marker. Deze test is aangepast van 13 en 10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster is een waardevolle modelorganisme om veroudering en pathologische degeneratieve processen te bestuderen in het zenuwstelsel. De voordelen van de vlieg als een experimenteel systeem omvatten de genetische traceerbaarheid, korte levensduur en de mogelijkheid te observeren en kwantitatief analyseren van complexe gedrag. De expressie van ziekte-gebonden genen in specifieke neuronale populaties van de Drosophila hersenen, kan worden gebruikt om menselijke neurodegeneratieve ziekten zoals Parkinson en Alzheimer 5 model. Dopaminerge (DA) neuronen zijn de meest kwetsbare neuronale populaties in het verouderen menselijke hersenen. Bij de ziekte van Parkinson (PD), de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening, de versnelde verlies van DA neuronen leidt tot een progressieve en onomkeerbare achteruitgang van motorische functie. Naast leeftijd en blootstelling aan giftige stoffen, is het verlies van DA neuronen versterkt door specifieke mutaties in de coderendeof promotorregio&#39;s van verschillende genen. De identificatie van dergelijke PD-geassocieerde allelen verschaft de experimentele basis voor het gebruik van Drosophila als een model voor neurodegeneratie van DA neuronen in vivo. Bijvoorbeeld, de expressie van de Parkinson-gerelateerde humane α-synucleine gen in Drosophila DA neuronen recapituleert sommige elementen van de menselijke ziekte, bijv. progressief verlies van DA neuronen en dalende motorische functie 2. Dienovereenkomstig is dit model met succes gebruikt om potentiële therapeutische targets te identificeren in PD 8. Hier beschrijven we twee assays die gewoonlijk zijn gebruikt om leeftijdsgebonden neurodegeneratie van DA neuronen te bestuderen in Drosophila: a climbing assay gebaseerd op het schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis reactie en tyrosine hydroxylase immunokleuring van hele volwassen hersenen zwellend aantal DA neuronen toezicht op verschillende leeftijden. In beide gevallen, in vivo expressie van UAS tspecifiek ransgenes in DA neuronen worden bereikt door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver lijn 3, 10.

We hebben de assays beschreven de rol van de stress beschermende Nrf2 signaalweg in een Drosophila model van PD 14. Dit model is gebaseerd op de expressie van het humane α-synucleine gen in DA neuronen met een TH Gal4 driver 2, 10. Figuur 1 toont een representatief resultaat van een schrikreactie geïnduceerde negatieve geotaxis (klimmen) test bij mannelijke vliegen die verschillende transgenen onder controle van de TH Gal4 driver. Alle getest...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt;: Het klimmen / schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis assay waarmee de functionele effecten van DA neuronen degeneratie en tyrosine hydroxylase immunokleuring die wordt gebruikt om DA neuronen in volledige hersenen mounts identificeren en tellen bestuderen.

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Olfactorische Testen voor muismodellen van neurodegeneratieve ziekte

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Het beoordelen van Primary neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s met behulp van Immunokleuring

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...