Name: assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Wir danken Leo Pallanck für Fliegenfischer Aktien, Christine Sommers für technische Unterstützung und Gerasimos P. Sykiotis für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch das NIH Ausbildungsförderung T32CA009363 zu MCB finanziert

1. Startle-induzierte Negative Geotaxis Assay <ol><li> Wählen Fliegen des gewünschten Genotyps, trennen sie nach Geschlecht, nach dem Zufallsprinzip Gruppe sie in Kohorten von 20-30 Tieren und kippen sie in neue Nahrung Fläschchen alle 2-3 Tage; Test jeder Satz von Fliegen (dh Alter abgestimmte Kohorten, eine Kohorte / Genotyp) mindestens einmal pro Woche. </li><li> Dreißig Minuten vor der negativen Geotaxis Test, betäuben die Fliegen mit CO 2 und legen Sie sie in pre-markierten klar Kunststof...

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

Die hier beschriebenen Assays stellen einen nützlichen Ansatz, um die Rolle von spezifischen Genen zu untersuchen, Signalwege oder kleinen Verbindungen bei der Aufrechterhaltung der DA Neuronen in Alterung sowie bei verschiedenen Krankheiten verbunden genetischen Hintergründen (Übersicht in 5). Die startle induzierten negativen Geotaxis Verhalten von Drosophila wurde ausgiebig als funktionelle Auslesen für die Funktionalität des DA Neuronen in unterschiedlichen genet...

Die Besonderheit des hier beschriebenen Assays beruht auf der Verwendung eines Gal4 Fliege Linie, die die regulatorischen Sequenzen der Tyrosin-Hydroxylase-Gen Expression in dopaminergen Neuronen 3 erreichen ausnutzt. Tyrosinhydroxylase katalysiert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Dopamin-Synthese. TH-Immunreaktivität in der erwachsenen Fliege Gehirn Überschneidungen mit der Dopamin, was TH ein guter Kandidat, um DA Neuronen in vivo (siehe zum Beispiel 6) zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Expression von THGal4 präziser als andere Gal4 Linien wie DdcGal4, die regulatorischen Sequenzen enthält der Dopa-Decarboxylase-Gen und treibt transgene Expression nicht nur in DA Neuronen, sondern auch in serotonergen Neuronen und Gliazellen Teilmengen von 3 . Feany und Bender (2000) zum ersten Mal beobachtet, dass pan-neuronale Expression der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen den fortschreitenden Verlust von sta beschleunigtrtle-induzierten negativen Geotaxis Verhalten in Drosophila. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit dem DA-Neuron-spezifische THGal4 Linie, um die Expression von α-Synuclein eine transgene 10 fahren beobachtet und verwendet diese funktionelle ausgelesen, um die neuroprotektive Rolle des Nrf2-Signalweg in dieser Studie Drosophila-Modell der PD 14. Die spezifischen Assay hier beschriebenen 2 und 3 angepasst. Die Drosophila Gehirn enthält mehr als 100 DA Neuronen, in mindestens 5 verschiedenen Clustern angeordnet (pPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), die visualisiert werden in ganze Gehirn Halterungen durch konfokale Mikroskopie können (siehe zum Beispiel 11 und 7). Es ist noch umstritten, ob die Anzahl der DA Neurone im Gehirn Drosophila mit dem Alter abnimmt 9, 11, jedoch altersabhängige Neurodegeneration bei Fliegen beobachtet wird, wo PD-chromosomale Gene mutiert worden / überexprimiert um menschliche Krankheiten zu modellieren5. Die Expression von humanen α-Synuclein in DA Neuronen hat eine solche Wirkung und damit als Modell für PD verwendet worden. Hier beschreiben wir einen Test für DA Neurone im gesamten Gehirns zählen Aktivierungen mit TH als Zell-Marker. Dieser Test wurde von 13 und 10 angepasst.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster ist ein wertvoller Modellorganismus zur Alterung und pathologischen degenerativen Prozessen im Nervensystem zu studieren. Die Vorteile der Fliege als experimentelles System sind seine genetischen Lenkbarkeit, kurze Lebensdauer und die Möglichkeit zu beobachten und quantitativ zu analysieren komplexe Verhaltensweisen. Die Ausprägung der Krankheitsresistenz-chromosomale Gene in spezifische neuronale Populationen der Drosophila Gehirn, können verwendet werden, um neurodegenerative Erkrankungen wie der Parkinson-und Alzheimer-5 zu modellieren. Dopaminergen (DA) Neurone gehören zu den am stärksten gefährdeten neuronale Populationen in der alternden menschlichen Gehirns. Bei der Parkinson-Krankheit (PD), die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung, führt der beschleunigte Verlust von DA Neuronen zu einer fortschreitenden und irreversiblen Rückgang der Funktion der Bewegungsorgane. Neben Alter und der Belastung durch Umweltgifte, ist der Verlust der DA Neuronen durch spezifische Mutationen in der kodierenden verschärftoder Promotor-Regionen von mehreren Genen. Die Identifizierung solcher PD-assoziierten Allele liefert die experimentelle Grundlage für die Verwendung von Drosophila als Modell zur Neurodegeneration DA Neuronen in vivo zu studieren. Zum Beispiel, der Ausdruck der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen in Drosophila DA Neuronen rekapituliert einige Merkmale der menschlichen Erkrankung, z. B. progressive Verlust von DA Neuronen und sinkende Bewegungsapparates Funktion 2. Dementsprechend ist dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um potentielle therapeutische Targets in PD 8 zu identifizieren. Hier beschreiben wir zwei Assays, die üblicherweise verwendet wurden, um altersabhängige Neurodegeneration DA Neuronen in Drosophila untersuchen: a Klettern Assay basiert auf der startle induzierten negativen Geotaxis Reaktion und Tyrosin Hydroxylase Immunfärbung der gesamten erwachsenen Gehirn montiert, um die Anzahl von Neuronen überwacht DA in verschiedenen Altersstufen. In beiden Fällen, in vivo-Expression von UAS transgenes speziell in DA Neuronen durch einen Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Promotor-Gal4 Treiberleitung 3, 10 erreicht werden.

Wir haben die verwendeten Assays beschrieben hier die Rolle der Beanspruchung schützende Nrf2-Signalweg in Drosophila Modell der PD 14 zu studieren. Dieses Modell beruht auf der Expression des humanen α-Synuclein-Gen in DA Neuronen mit einem TH Gal4 Treiber 2, 10. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Schreckreaktion-induzierten negativen Geotaxis (Klettern)-Assay in männlichen Fliegen, die verschiedene Transgene unter der Ko...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt;: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

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Neurowissenschaften

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

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