Name: assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Agradecemos Leo Pallanck para as populações da mosca, Christine Sommers de assistência técnica e Gerasimos P. Sykiotis para discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelo NIH formação concessão T32CA009363 para MCB

1. Sobressalto induzida Ensaio geotaxis Negativo <ol><li> Selecione moscas do genótipo desejado, separá-los por gênero, aleatoriamente agrupá-los em grupos de 20-30 animais e lançá-los em novos frascos de comida a cada 2-3 dias, teste cada conjunto de moscas (ou seja, grupos pareados por idade, uma coorte / genótipo) pelo menos uma vez por semana. </li><li> Trinta minutos antes do teste geotaxis negativo, anestesiar as moscas com CO 2 e colocá-los em tubos de plástico transparente pré-rot...

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

Os ensaios descritos aqui proporcionam uma abordagem útil para estudar o papel de genes específicos, as vias de sinalização ou de compostos pequenos na manutenção de neurónios DA em envelhecimento, bem como em diferentes fundos genéticos doenças ligadas (revisto em 5). O comportamento negativo geotaxis sobressalto induzida de Drosophila tem sido amplamente utilizada como um funcional leia-out para a funcionalidade do AD neurônios em diferentes origens genéticas...

A especificidade dos ensaios descritos aqui baseia-se no uso de uma linha de mosca Gal4 que explora as sequências reguladoras do gene da hidroxilase de tirosina, para conseguir a expressão específica de neurónios dopaminérgicos 3. Tirosina hidroxilase catalisa a primeira e passo limitante da velocidade na síntese de dopamina. Imunorreactividade TH na mosca sobrepõe cérebro adulto com a da dopamina, tornando TH um bom candidato para identificar neurónios DA in vivo (ver, por exemplo 6). Além disso, o padrão de expressão THGal4 é mais específico do que a de outras linhas, tais como Gal4 DdcGal4, que contém as sequências reguladoras a partir do gene da dopa descarboxilase e dirige a expressão transgénica não apenas em neurónios DA, mas também nos neurónios serotoninérgicos e subconjuntos de células gliais 3 . Feany e Bender (2000) observaram pela primeira vez que a expressão de pan-neuronal do gene α-sinucleína humana DP-linked acelera a perda progressiva de stageotaxis comportamento negativo rtle induzida em Drosophila. Temos observado resultados similares usando a linha DA-neurônio específico THGal4 para conduzir o expressionof uma α-sinucleína transgene 10 e usou este funcional de leitura para estudar o papel neuroprotetor da via Nrf2 neste Drosophila modelo de PD 14. O ensaio específico aqui descrito é adaptado a partir de 2 e 3. O cérebro de Drosophila contém mais de 100 neurónios DA, dispostos em, pelo menos, cinco grupos diferentes (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, ppm3) que podem ser visualizados nos seus suportes de a totalidade do cérebro por meio de microscopia confocal (ver, por exemplo, 11 e 7). É ainda controverso se o número de neurónios DA em declínios cerebrais Drosophila com 9 anos de idade, 11, no entanto, dependente da idade, a neurodegeneração é observada nas moscas onde os genes PD-linked foram mutados / overexpressed para modelar doenças humanas5. A expressão de humano α-sinucleína em DA neurónios tem tal efeito e, consequentemente, tem sido utilizada como um modelo para a DP. Aqui nós descrevemos um ensaio para neurônios DA contar no cérebro todo montado usando TH como um marcador de células. Este ensaio foi adaptado a partir de 13 e 10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster é um organismo modelo valioso para estudar processos degenerativos do envelhecimento e patológicas do sistema nervoso. As vantagens da mosca como um sistema experimental incluir sua rastreabilidade genética, vida curta ea possibilidade de observar e analisar quantitativamente os comportamentos complexos. A expressão de genes ligados à doença em populações neuronais específicas do cérebro de Drosophila, pode ser usado para modelar doenças neurodegenerativas humanas, tais como a doença de Parkinson e de Alzheimer 5. Dopaminérgicos (DA) neurônios estão entre as populações mais vulneráveis ​​neuronais no cérebro humano envelhecimento. Na doença de Parkinson (DP), a desordem de movimento neurodegenerativa mais comum, a perda acelerada de DA neurónios conduz a uma deterioração progressiva e irreversível da função locomotora. Além da idade e exposição a toxinas ambientais, a perda de neurónios DA é exacerbado por mutações pontuais no codificanteou regiões promotoras dos vários genes. A identificação de tais alelos DP associados fornece a base experimental para a utilização de Drosophila como um modelo para estudar a neurodegeneração de neurónios DA in vivo. Por exemplo, a expressão do gene α-sinucleína humana PD-ligados em Drosophila neurônios DA recapitula algumas características da doença humana, por exemplo, perda progressiva de neurônios DA e declínio da função locomotora 2. Assim, este modelo tem sido utilizado com sucesso para identificar potenciais alvos terapêuticos na DP 8. Aqui nós descrevemos dois ensaios que têm sido comumente usados ​​para estudar a neurodegeneração idade-dependente de Da neurônios em Drosophila: um ensaio de escalada com base na resposta de sobressalto geotaxis negativa induzida e tirosina hidroxilase immunostaining de cérebro adulto todo monta para monitorar o número de neurônios DA em diferentes idades. Em ambos os casos, a expressão in vivo de t UASransgenes especificamente em neurónios DA pode ser conseguido através de uma tirosina-hidroxilase (TH)-Gal4 promotor de linha de condutor 3, 10.

Usamos os ensaios descritos aqui para estudar o papel do protector via Nrf2 o stress num modelo de Drosophila de DP 14. Este modelo baseia-se na expressão do gene α-sinucleína humana em neurónios DA utilizando um condutor de Gal4 TH 2, 10. A Figura 1 mostra um resultado representativo de um sobressalto induzidas geotaxis negativos (subida) de ensaio nas moscas macho que expressam transgenes diferentes sob o controlo do controlador de TH Gal...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA) neurônios<em&gt; Drosophila</em&gt;: A escalada / ensaio geotaxis negativa induzida sobressalto que permite estudar os efeitos funcionais de neurónios DA degeneração e a imunomarcação de tirosina-hidroxilase, que é usado para identificar e contar os neurónios do cérebro de DA em montagens inteiras.

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