Name: assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Vi tackar Leo Pallanck för klipska bestånd, Christine Sommers för tekniskt bistånd och Gerasimos P. Sykiotis för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats av NIH utbildningsstipendium T32CA009363 till MCB

Ett. Startle-inducerad Negativ geotaxis Assay <ol><li> Välj flugor av önskad genotyp, separera dem med kön, slumpmässigt gruppera dem i kohorter av 20-30 djur och vända dem till nya livsmedel flaskor var 2-3 dagar, testa varje uppsättning av flugor (dvs. åldersmatchade kohorter, en kohort / genotyp) minst en gång i veckan. </li><li> Trettio minuter innan den negativa geotaxis testet, söva flugor med CO 2 och placera dem i pre-märkta tydliga plaströr gjorda med två tomma mat injektionsfl...

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

De analyser som beskrivs här ger en användbar metod för att studera betydelsen av specifika gener, signalvägar eller små föreningar i underhållet av DA-neuroner i åldrandet samt i olika sjukdomar kopplade genetisk bakgrund (översikt i 5). Den spritta-inducerade negativa geotaxis beteende Drosophila har i stor utsträckning använts som en funktionell läs-out för funktionaliteten av DA-neuroner i olika genetisk bakgrund, särskilt i närvaro av PD-kopplade mutat...

Specificiteten av analyserna beskrivs här förlitar sig på användningen av en Gal4 fluglina som utnyttjar de regulatoriska sekvenserna av tyrosinhydroxylas genen för att uppnå specifika uttryck i dopaminerga neuroner 3. Tyrosin hydroxylas katalyserar det första och hastighetsbegränsande steget i dopaminsyntes. TH immunoreaktivitet i de vuxna överlappar flyga hjärnan med den hos dopamin, vilket gör TH en bra kandidat för att identifiera DA-neuroner in vivo (se till exempel 6). Dessutom är uttrycksmönstret av THGal4 mer specifik än den hos andra Gal4 linjer såsom DdcGal4, som innehåller regulatoriska sekvenser från dopadekarboxylas genen och driver transgent uttryck inte bara i DA-neuroner, men också i serotoninerga neuroner och delmängder av gliaceller 3 . Feany och Bender (2000) konstaterade först att pan-neuronala uttryck av PD-länkade humant α-synuklein gen accelererar gradvis förlust av startle-inducerad negativ geotaxis beteende i Drosophila. Vi har observerat liknande resultat med användning av DA-neuron specifik THGal4 linje att driva expressionof en α-synuclein-transgenen 10 och används denna funktionella utläsning för att studera den neuroskyddande roll Nrf2 banan i detta Drosophila modell av PD 14. Den specifika analys som beskrivs här är anpassad från 2 och 3. Den Drosophila hjärnan innehåller mer än 100 DA-neuroner, arrangerade i åtminstone fem olika kluster (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) som kan visualiseras i hela hjärnan monteringar genom konfokal mikroskopi (se till exempel 11 och 7). Det är fortfarande kontroversiellt huruvida antalet DA nervceller i Drosophila hjärnan avtar med åldern 9, 11, men är åldersberoende neurodegeneration observerats i flugor där PD-länkade gener har muterat / overexpresseds att modellera mänskliga sjukdomarFem. Uttrycket av humant α-synuklein i DA nervceller har en sådan effekt och, följaktligen, har använts som en modell för PD. Här beskriver vi en analys för DA nervceller räknas i hela hjärnan monterar använder TH som en cell markör. Denna analys har anpassats från 13 och 10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster är en värdefull modell organism för att studera åldrande och sjukliga degenerativa processer i nervsystemet. Fördelarna med fluga som ett experimentellt system inkluderar dess genetiska spårbarhet, kort livslängd och möjligheten att observera och kvantitativt analysera komplexa beteenden. Uttrycket av sjukdom-länkade gener i specifika neuronala populationer av Drosophila hjärnan, kan användas för att modellera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons och Alzheimers 5. Dopaminerga (DA) nervceller är bland de mest sårbara neuronala populationer i den åldrande människans hjärna. Vid Parkinsons sjukdom (PD), den vanligaste neurodegenerativa rörelsestörningar, leder den accelererade förlusten av DA neuron till en progressiv och irreversibel nedgång i rörelseapparaten funktion. Förutom ålder och exponering för miljögifter, är förlust av DA neuron förvärras av specifika mutationer i den kodandeeller promotorn regioner i de olika gener. Identifieringen av sådana PD-associerade alleler ger den experimentella grunden för användningen av Drosophila som en modell för att studera neurodegeneration i DA nervceller in vivo. Till exempel uttrycket av PD-länkade humant α-synuklein gen i Drosophila DA nervceller rekapitulerar vissa funktioner i den mänskliga sjukdomen, t.ex. progressiv förlust av DA neuron och minskande motorisk funktion 2. Följaktligen har denna modell använts framgångsrikt för att identifiera potentiella terapeutiska mål i PD 8. Här beskriver vi två analyser som ofta har använts för att studera åldersberoende neurodegeneration av DA nervceller i Drosophila: a klättring analys baserad på spritta-inducerade negativa geotaxis respons och tyrosinhydroxylas immunfärgning av hela den vuxna hjärnan fästen för att övervaka antalet DA nervceller vid olika åldrar. I båda fallen, in vivo-expression av UAS transgenes bestämt i DA-neuroner kan uppnås genom användning av en tyrosinhydroxylas (TH)-promotor-Gal4 föraruppställning 3, 10.

Vi har använt de analyser som beskrivs här för att studera vilken roll stress skyddande Nrf2 väg i en Drosophila modell av PD 14. Denna modell bygger på uttrycket av den humana α-synuklein gen i DA nervceller med hjälp av en TH Gal4 förare 2, 10. Figur 1 visar ett representativt resultat av en spritta-inducerade negativa geotaxis (klättring) analys i manliga flugor som uttrycker olika transgener under kontroll av TH Gal4 föraren. Alla...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Här beskriver vi två analyser som har inrättats för att studera åldersberoende neurodegeneration av dopaminerga (DA) neuroner i<em&gt; Drosophila</em&gt;: Klättring / spritta-inducerade negativa geotaxis analys som gör det möjligt att studera de funktionella effekterna av DA neuron degeneration och tyrosinhydroxylas immunofärgningen som används för att identifiera och räkna DA nervceller i hela hjärnan fästen.

Uppskatta Neurodegenerativa Fenotyper i<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerga neuroner genom att klättra Analyser och Helhjärnstänkande immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissektion och kultur mus dopaminerga och Striatala Explantat i tredimensionella analyser kollagenmatris

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektering av protein palmitoylering i odlade hippocampus neuroner genom immunprecipitation och Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Olfactory Analyser för musmodeller av neurodegenerativ sjukdom

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Kvantitativ analys av Klättring Defekter i en Drosophila modell av neurodegenerativa sjukdomar

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Bedöma Primär Neurogenesis in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryon Använda Immunofärgning

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analysera Synaptic Modulering av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptorer Efter exponering för Förlängd ljus

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...