Name: ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Het project werd ondersteund door NIH-subsidie ​​U01HL098180 van de National Heart, Lung, and Blood Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Heart, Lung, and Blood Institute of de National Institutes of Health

1. Reagentia Setup 1.1 Dissection en Imaging Medium Leibovitz L-15 medium (L15) aangevuld met FBS (10%) en penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml penicilline G natrium en 100 ug / ml streptomycine sulfaat) wordt gebruikt zowel bij oogst en beeldvorming van trachea monsters. 2. Ondiepe Walled Cultuur Kamer Vergadering De kamer gebruikt trachea weefsel wordt getoond in figuur 1. De vloer van ...

<ol>
	<li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance.">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li><li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway.">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li><li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

Meting van cilia slagfrequentie (CBF) is relatief eenvoudig met behulp van hoge microscoop doelstellingen vermogen en snelle image acquisitie hardware 13,15, en legt uit waarom CBF metingen vormen de basis van de meeste onderzoeken naar mucociliaire klaring tijdens gezondheid en ziekte. Hoewel CBF ook essentieel voor het begrijpen van mucociliaire klaring, meting van CBF alleen voorbij de onderliggende belang van beide ciliaire gegenereerde stroom en cilia slaan golfvorm, die beide zijn moeilijker te meten, w...

Analyse van beweeglijke cilia functie in het luchtwegepitheel is experimenteel belangrijk voor het ophelderen van de genetische en omgevingsfactoren die mucociliaire klaring en pulmonaire gezondheid 1 beïnvloeden. De eenvoudig protocol ontwikkeld voor de beeldvorming van de muis luchtwegepithelen biedt een efficiënte methode om de luchtwegen trilharen beweeglijkheid ondervragen in mutant en knockout muismodellen en vereisen alleen basisvaardigheden in muis tracheaweefsel dissectie en ex vivo beeldvorming van de luchtwegen trilharen beweeglijkheid met een hoge resolutie videomicroscopie. Dit protocol werd opgesteld en verfijnd tijdens een grootschalige muis mutagenese screen om een snelle evaluatie van de beweeglijke trilharen functie (cilia slagfrequentie, cilia verslaan vorm, cilia gegenereerde stroom) toelaten in mutanten met een aangeboren hartaandoening in verband met heterotaxy 2-5. Voor deze technieken om luchtwegen cilia beweeglijkheid studie kunnen worden gegroepeerd in hetzij de acute ex vivo aard of longer term in vitro experimentele benaderingen. Acute experimenten zijn ex vivo visualisatie van de menselijke neus / luchtwegen borstel biopten 6,7 en analyse van eenvoudige dwarse luchtwegen secties 8. De in vitro benaderingen gebruiken diverse celkweek technieken om vellen van gedifferentieerde trilharen epitheel, zoals in de lucht-water grensvlak culturen of luchtwegen suspensiekweken 9-11 genereren. Echter, deze luchtwegepitheel reciliation technieken vereisen zeer aanzienlijke investering in tijd en training voordat bruikbare gecilieerde epitheliale cellen worden geproduceerd in experimenten (4-6 weken 9,10). Terwijl acute ex vivo analyse van luchtwegepitheel borstel biopsies worden gewoonlijk gebruikt voor menselijke klinische studies, is deze methode niet bruikbaar muisstudies verergerd door mechanische weefselschade 12. De techniek die in dit protocol voor de analyse van mouse tracheale luchtwegepitheel is niet alleen eenvoudig te voeren, maar vereist geen speciale vaardigheden of dissectie gespecialiseerde inrichtingen naast die standaard beeldvormend videomicroscopie. Er zijn veel voordelen aan deze eenvoudig protocol. Ten eerste, omdat de muis trachea weefsel oogsten is snel en eenvoudig uit te voeren, is het mogelijk een snelle vaststelling van de luchtwegen cilia functie in een groot aantal muizen. Dit zijn acute analyse van de korte termijn effecten van verschillende in vitro behandelingen. Ten tweede wordt een ex vivo techniek de trilharen luchtwegepitheel bevestigd blijft aan het onderliggende steunweefsel en daarmee geassocieerde signaaltransductie wegen behouden. Daarom in vergelijking met in vitro reciliated luchtwegepitheel, dit preparaat is een betere weergave van de natuurlijke in vivo weefselmilieu. Ten derde, dit protocol kan de verwerving van een aantal verschillende kwantitatieve parameters die de objectieve beoordeling van beweeglijke cilia f kan biedenzalving. Tenslotte, in tegenstelling tot andere methoden voor de luchtwegen trilharen visualisatie Dit protocol maakt visualisatie van de cilia loodrecht op de trilharen ritme richting, waardoor profiel te bekijken van de cilia die optimaal is voor een hoge resolutie afbeelding van cilia beat en metachronalgolven golfopwekking . Dit protocol kan worden gemodificeerd op een aantal manieren om een ​​groot aantal experimentele behoeften zoals de rol van farmacologische middelen, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals mucus belast luchtwegen trilharen functie en productie / onderhoud pakken luchtwegen trilharen beat en metachronalgolven golfvoortplanting.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

Een ex vivo techniek voor beeldvorming muis luchtwegepitheel voor de kwantitatieve analyse van beweeglijke cilia functie belangrijk inzicht in mucociliaire klaring functie werd vastgesteld. Vers geoogste muis luchtpijp wordt overlangs doorgesneden de trachealis spieren en gemonteerd in een ondiepe ommuurde kamer op een glazen bodem schotel. De trachea monster geplaatst langs zijn lengteas te profiteren van de trachealis spier langsrichting krullen. Dit maakt beeldvorming van ciliaire beweging in het profiel te bekijken langs de gehele tracheale lengte. Video met 200 frames / sec worden verkregen met behulp van differentieel interferentie contrast microscopie en een hoge-snelheid digitale camera aan de kwantitatieve analyse van cilia slagfrequentie en ciliaire golfvorm laten. Met de toevoeging van fluorescerende kralen tijdens beeldvorming, cilia gegenereerd fluïdumstroming ook kan worden bepaald. Het protocol tijd omspant ongeveer 30 minuten, met 5 min voor Kamer voorbereiding, 5-10 minuten voor het monstermontage en 10-15 min bij videomicroscopie.

Controle luchtwegen trilharen moet duidelijk zichtbaar zijn en gezien te verslaan in een gecoördineerde wijze (Aanvullende Film 1; filmweergave wordt vertraagd tot 15% real-time), met merkbare stroming in de richting van cilia beat (aanvullende Movie 2; filmweergave is 100% real time). Kwantificering van cilia films moeten de resultaten vergelijkbaar met dat in figuur 3 opleveren. Collectie van high-speed DIC films maakt de kwantificering van cilia slagfrequentie <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporele Mapping van Motiliteit in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Bereidingen van de darmen

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Ex vivo-methode voor het beoordelen van het voortplantingsstelsel van muizen spontane beweeglijkheid en een op MATLAB gebaseerd baarmoeder bewegings Volgalgoritme voor gegevensanalyse

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...