Name: ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Projektet stöddes av NIH bidrag U01HL098180 från National Heart, Lung, and Blood Institute. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Heart, Lung, and Blood Institute eller National Institutes of Health

Ett. Reagens Setup 1.1 Dissection och bildalstringsmedium Leibovitz L-15 medium (L15) kompletteras med FBS (10%) och penicillin-streptomycin (100 enheter / ml av penicillin G natrium och 100 | ig / ml streptomycinsulfat) används under både skörd och avbildning av luftstrupe prover. 2. Grunt muromgärdade Culture Chamber Assembly Kammaren används för att hålla luftstrupen vävnad visas i figur 1.</st...

<ol>
	<li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance.">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li><li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway.">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li><li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

Mätning av cilia slagfrekvens (CBF) är relativt lätt att använda höga mål power mikroskop och snabb bildtagning hårdvara 13,15, och förklarar varför CBF mätningar ligger till grund för de flesta studier som undersöker mucociliary clearance vid hälsa och sjukdom. Men medan CBF mätning är väsentliga för förståelsen mucociliary clearance, mätning av CBF enbart ignorerar den underliggande betydelsen av både genererade ciliär flöde och flimmerhår slå vågform, som båda är svårare att m?...

Analys av rörliga flimmerhår funktion i luftvägsepitel är experimentellt betydelse för undersökningen av de genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka mucociliary clearance och pulmonell hälsa 1. Den enkla protokoll som utvecklats för avbildning musen luftvägsepitel ger en effektiv metod för att förhöra motilitet luftvägarna flimmerhår i mutant och knockout musmodeller och kräver endast grundläggande kunskaper i mus trakeal vävnad dissektion och ex vivo avbildning av luftvägarna cilier motilitet med hög upplösning videomikroskopi. Detta protokoll upprättas och förfinats under en storskalig mus mutagenesis skärmen för att möjliggöra snabb utvärdering av rörliga flimmerhår funktion (flimmerhår svävningsfrekvensen, flimmerhår slå form, cilier genererade flöde) i mutanter med medfödd hjärtsjukdom förknippad med heterotaxy 2-5. Aktuella tekniker som används för att studera motilitet luftvägarna cilier kan grupperas i antingen akut ex vivo typ eller lonGer term in vitro experimentella metoder. Akuta experiment inkluderar ex vivo visualisering av humana nasala / luftvägar borste biopsier 6,7 och analys av enkla tvärgående luftvägarna avsnitt 8. De in vitro-metoder använder olika cellodlingstekniker att generera ark differentierad cilierade epitel, t.ex. i luft vätskegränsytan kulturer eller luftvägarna kulturer fjädring 9-11. Men dessa luftvägsepitel reciliation tekniker kräver mycket stora investeringar i tid och träning innan några användbara cilierade epitelceller produceras för experiment (4-6 veckor 9,10). Medan akut ex vivo analys av luftvägsepitelceller borste biopsier används ofta för kliniska studier, är denna metod inte kan användas musstudier grund förvärras mekanisk vävnadsskada 12. Tekniken som beskrivs i detta protokoll för analys av mouse luftrör luftvägsepitel är inte bara enkel att utföra, men det kräver inga speciella dissektion kompetens eller någon specialutrustning förutom de standard för avbildning av videomikroskopi. Det finns många fördelar med denna enkelt protokoll. Först, som musen luftstrupen vävnad skörd är snabb och enkel att utföra, gör det för snabb bedömning av luftvägarna flimmerhår funktion i ett stort antal möss. Detta kan inkludera akut analys av de kortsiktiga effekterna av olika in vitro behandlingar. Andra, som en ex vivo teknik förblir cilierade luftvägsepitel fäst vid den underliggande stödjande vävnader och därmed bevara tillhörande cell signalvägar. Därför i jämförelse med in vitro reciliated luftvägsepitel, är detta preparat en bättre representation av den naturliga in vivo vävnad miljö. Tredje, medger detta protokoll förvärv av ett antal olika kvantitativa parametrar som kan ge en objektiv bedömning av rörliga flimmerhår fsmörjelse. Slutligen, i motsats till andra nuvarande metoder för luftvägarna cilier visualisering, ger detta protokoll för visualisering av cilier i rät vinkel mot flimmerhåren slå riktningar, vilket gör profilvy av cilier som är optimal för högupplösande avbildning av cilia beat och metachronal vågalstring . Detta protokoll kan modifieras på ett antal sätt att hantera ett brett spektrum av experimentella behov såsom den roll av farmakologiska medel, genetiska faktorer, miljömässiga exponeringar och / eller mekaniska faktorer såsom slem belastning på luftvägarna cilier funktion och produktion / underhåll av luftvägarna cilier beat och metachronal vågutbredning.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

En ex vivo teknik för avbildning mus luftvägsepitel för kvantitativ analys av rörliga flimmerhår funktion viktigt för insikt mucociliary clearance funktion har fastställts. Nyskördade mus luftstrupen skärs i längdriktningen genom trachealis muskler och monterad i en grund muromgärdad kammare på ett glas botten maträtt. Luftstrupen Provet är placerad utmed dess längdaxel för att dra nytta av den trachealis muskeln att krypa longitudinellt. Detta tillåter avbildning av ciliär rörelse i profilvyn längs hela trakeal längd. Videoklipp på 200 bilder / sek erhålles med differential mikroskopi interferens kontrast och en hög hastighet digitalkamera för att möjliggöra kvantitativ analys av cilia svävningsfrekvensen och ciliary vågform. Med tillägg av fluorescerande pärlor under avbildning, även flimmerhår genererade vätskeflöde kan bestämmas. Protokollet tidsperioderna ca 30 min, med 5 min för kammare beredning, 5-10 min för provmontering, och 10-15 min för videomikroskopi.

Kontroll luftvägarna cilier ska vara klart synliga och sett att slå på ett samordnat sätt (Supplemental Movie 1, filmuppspelning saktas till 15% realtid), med märkbar flöde i riktning flimmerhår slå (Supplemental Movie 2, filmuppspelning är 100% realtid). Kvantifiering av flimmerhår filmer bör ge resultat som liknar den som ses i figur 3. Insamling av höghastighetståg DIC filmer möjliggör kvantifiering av cilier svävningsfrekvensen (fig 3C)</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

En enkel och tillförlitlig teknik för att visualisera och kvantifiera motilitet luftvägarna cilier och flimmerhår genererade flödet med mus luftstrupen beskrivs. Denna teknik kan modifieras för att avgöra hur ett stort antal faktorer påverkar cilia motilitet, inklusive farmakologiska medel, genetiska faktorer, miljömässiga exponeringar och / eller mekaniska faktorer såsom slem belastning.

Ex vivo-metod för högupplöst avbildning av Cilia Motility i Rodent luftvägsepitel

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal cellkulturer från Aplysia för högupplöst avbildning av tillväxt Kottar

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Högupplöst video Spårning av rörelseorgan hos vuxna Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging av intakt Drosophila Larver på sub-cellulära upplösning

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Spatiotemporal Kartläggning av motilitet i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Förberedelser tarm

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

En högupplöst metod för att övervaka Phosphorylation-beroende aktivering av IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Ex vivo metod för att bedöma mus reproduktionsorganen spontan motilitet och en MATLAB-baserade livmodern motion tracking algoritm för data analys

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...