Name: measuring intracellular ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell

Författarna tackar Jose Luis De la Vega, Erika Melchy och Dr Takuya Nishigaki för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexiko) (99.333 och 128.566 till CT), Dirección General de Asuntos del Personligt Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 till CT).

I denna artikel rapporterar användningen av de fyra ovan nämnda tekniker för att mäta [Ca 2 +] i förändringar i humana spermier. Vi använde progesteron för att utlösa en Ca 2 + svar, eftersom det är väl känt att denna steroid producerar en övergående [Ca2 +] Jag ökar i spermier. I synnerhet, i mänskliga spermier, aktiverar progesteron direkt en Ca 2 +-kanal (nämligen CatSper) uttrycks uteslutande i plasmamembranet hos spermier 10,11....

<ol>
	<li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule:+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain.">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li><li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+in+the+development,+maturation,+and+function+of+spermatozoa.">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li><li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect.">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li><li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein.">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li><li>Carlson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+targeting+of+native+CatSper+channels+reveals+a+required+role+in+maintenance+of+sperm+hyperactivation.">Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation.</a> PLoS ONE. 4, e6844 (2009).</li><li>Brokaw, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+flagellar+response+during+the+chemotaxis+of+bracken+spermatozoids.">Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids.</a> J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).</li><li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway.">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121, 1139-1150 (1995).</li><li>Svahn, H. A., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cells+or+large+populations.">Single cells or large populations.</a> Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li><li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2++influx+in+human+sperm.">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li><li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels.">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li><li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3.">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li><li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+progesterone:+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone.">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li><li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+activates+the+principal+Ca2++channel+of+human+sperm.">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li><li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BSA-induced+Ca2++influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent.">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).</li><li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+sperm+capacitation:+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation.">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li><li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa.">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li></ol>

Intracellulär signalering är avgörande för de flesta cellulära aktiviteter, Ca2 + är en allestädes närvarande budbärare som åtföljer däggdjursceller under hela deras livscykel, från sitt ursprung vid befruktningen till slutet av sin livscykel. Som svar på olika stimuli, [Ca2 +] i ökar, oscillerar och minskar med tid och rum kodifiering, följaktligen, är olika processer aktiveras, modulerade eller avslutas av Ca2 +-kodade meddelanden. Intracellulär Ca 2 + dyna...

Ca2 + är en universell andra budbärare av signaltransduktionsvägar i eukaryota celler. Intracellulära Ca2 + (Ca 2 + i) deltar i regleringen av många grundläggande fysiologiska processer i både hetsiga och icke-retbara celler. Vikten och universalitet Ca2 + som andra budbärare under signaltransduktionshändelser härrör från dess tid och rum mångsidighet i överföringen av uppgifter i cellen. Medan Ca2 + kan inte syntetiseras de novo eller degraderas i cellen, dess intracellulära koncentrationen ([Ca2 +] i) hålls inom mycket snäva gränser genom olika cellulära mekanismer som kontinuerligt buffert, sequester, kategoriserar, och / eller ackumuleras Ca 2 +. Förändringar i koncentrationen av denna jon kan förekomma i mycket lokaliserade områden inom cellen 1, och dechiffrera sådana svängningar är nödvändig för att få en deEPER förståelse av (1) deras roll i den signalerande mekanismen, (2) deras fysiologiska betydelse, och (3) allmänna mekanismer för cellsignalering. Ca2 +-medierad signalering är av särskild betydelse i sperma fysiologi 2. Spermiemotilitet är en av de viktigaste funktionerna för gödsling framgång, och i själva verket kan flera spermiernas rörlighet defekter orsaka sterilitet 3-5. Vikten av Ca 2 + i flagellar rörelse har länge insett 6, men det är mekanismen för hur Ca 2 + styr den särskilda formen av flagellära böjning inte helt klarlagda. Innan sammansmältning med ägget, måste spermierna genomgå capacitation, en komplex process som är avhängig spermier bostad innanför kvinnliga tarmkanalen. Under capacitation, är spermierna membranets lipid arkitektur och organisation ändras, främst som ett resultat av kolesterol avlägsnas från plasmamembranet. Dessutom flera proteiner är tyrosin-fosforylated 7. Viktigt under capacitation finns det en ökning av intracellulärt pH (pH i) och i [Ca 2 +] i, och membranpotentialen hyperpolariserar hos vissa arter 2. Capacitation sker enbart i en delpopulation av spermier (20-40%), och de mekanismer som är involverade i alla dessa cellförändringar är långt ifrån klart. Det är allmänt accepterat att endast en subpopulation av capacitated spermier genomgå akrosomreaktionen (AR) när den utsätts för fysiologiska induktorer. AR är också en Ca2 +-reglerade omständigheter behövs för befruktning i alla arter som har en Akrosomen (specialiserad organell med yttre och inre membran). Under denna process de yttre akrosomala membranet säkringar med spermiens plasmamembranet, släppa hydrolytiska enzymer som tillåter spermie att penetrera Glyco-proteinartade matrisen som omger ägget (zona pellucida, eller ZP). AR exponerar också en ny fusogen yta spermie som interagerar medägget plasmamembranet för den slutliga fusionen av båda gameter. Det finns flera cellulära ligander som inducerar AR, progesteron är en av de mest studerade bland dem. I detta arbete presenterar vi fyra olika tekniker som innefattar användning av en Ca 2 +-känsliga fluorescerande färg för att mäta [Ca 2 +] i förändringar i mänskliga spermier utlöses av progesteron (med undantag för flödescytometri, där vi mätte [Ca 2 + ] Jag ökar induceras vid in vitro capacitation process). I detta fall använde vi Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), ett membran-genomsläppligt färgämne med ett Kd = 325 nM. In vitro vi övervakas fluorescens ändras som en funktion av tiden med tre av de metoder, och med den fjärde tekniken mätte vi fluorescensvärden vid en enda given tidpunkt. Dessa olika synsätt kompletterar varandra, eftersom sammanlagt ger de rumsliga och tidsmässiga resolution på både enskild cell och cellnivåer befolkning. Cell Befolkning eller Bulk Experiment Bulk tekniker används flitigt inte bara för att de instrument de behöver är lätt tillgängliga, men också för att de är enkla, väl etablerade, och möjliggöra utjämning av information från mätningar utförda på miljontals celler i ett enda experiment. Teknik # 1. Konventionell fluorometri Denna teknik övervakar förändringar i fluorescens som en funktion av tid, de försöken utförs i glas Kyvett med provvolymer som sträcker sig från 200 till 1000 | il. Korrekt blandning av tillsatta reagens kräver magnetisk omröring, och därför den temporala upplösningen som erhålls är i storleksordningen sekunder. Den typiska cellkoncentrationen utbud av de analyserade proverna är 10 5 -10 8 celler / ml. Teknik # 2. Stoppad Flow fluorometri Thans teknik övervakar också förändringar i fluorescens som en funktion av tiden, men reagensen snabbt blandas (med tryck) i en inspelning kyvett innehållande en mycket liten provvolym (allt från 25 till 100 l). Därför är homogenisering av reagenser momentana, vilket möjliggör en hög temporal upplösning i storleksordningen millisekunder. Analys av de resulterande fluorescens mot tid spår är lämpliga för att bestämma reaktionshastigheter, belysa komplexiteten i reaktionsmekanismen, erhålla information om kortlivade reaktionsmellanprodukter, etc. Den gemensamma cellkoncentrationen sortiment av de analyserade proverna är 10 5 -10 7 celler / ml. Single Cell Experiment Bulk experiment rapporterar genomsnittliga beteendet hos ett stort antal celler, dock kan en population ofta uppvisar heterogena egenskaper som förbises vid denna typ av mätningar. Encelliga tekniker används således för att komplettera the information som erhållits med experiment cellpopulation. Teknik # 3. Flödescytometri Trots betydelsen av den information som härrör från en enda cell mätningar är det viktigt att analysera ett stort antal celler för att förhindra den felaktiga extrapolering av cell-specifika egenskaper till en hel population. Av detta skäl är hög genomströmning tekniker gynnat och den mest populära metoden är flödescytometri, där 10.000 celler per betingelse konventionellt analyseras. Denna metod gör multi-parametrisk analys av heterogena populationer som det kategoriserar celler enligt deras storlek (ljusspridning framåt (FSC)), granularitet (sidospridning (SSC)) och fluorescensintensitet (specifik märkning med en antikropp, viabilitet markör etc.) , vilket ger information om de parametrar &quot;fördelning för en grupp av celler. Flödescytometri ger omedelbar stället tidsberoende uppgifter 8. Framåt och side scatter värden ARe också användbart för att välja en grind som innehåller celler, men diskriminerar cellulärt skräp, damm, etc. För fluorescensmätningar, negativa och positiva fluorescens kontroller ska också ingå. Om mer än en fluorescens kanal används, måste en process som kallas kompensation utföras (för detaljer se <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Ersättning tillåter spektral överlappning diskriminering bland fluoroforer. Flödescytometri tillåter också diskriminering av döda celler, i allmänhet med hjälp av propidiumjodidfärgning. Technique # 4. Single Cell Imaging Mikroskopi är en annan vanlig metod för att studera enda cell beteende, det är väl lämpad för tidsberoende studier och det ger också rumslig upplösning. En stor nackdel är att hög genomströmning analys är endast i sin linda i dagsläget <sup&gt; 9.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F-10</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N-6013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A-7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-3881</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Makler Counting Chamber</td>
 <td>SEFI Medical Insruments LTD</td>
 <td>SEF-MAKL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>20 vials/50 &mu;g each</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin</td>
 <td>Alomone</td>
 <td>I-700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Progesterone</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P0130</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S-9888</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P-3911</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium bicarbonate</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3506</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M-2670</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-1016</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H-3125</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Glucose</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>1906-01</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium pyruvate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P-2256</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium L-lactate (aprox. 99%)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L- 7022</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L-7011 </td>
 <td>Component B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)</td>
 <td>Sigma- Aldrich</td>
 <td>X-100</td>
 <td>2.4 mM solution in water </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round coverslip </td>
 <td>VWR</td>
 <td>48380 080</td>
 <td>25 mm diameter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine solution </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manganese chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M-3634</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attofluor; Cell Chamber, for microscopy</td>
 <td>Life technologies</td>
 <td>A-7816</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>5x5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measuring intracellular ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging

Spermier är manliga könsceller speciellt utformade för att nå, erkänna och smälta samman med ägget. För att utföra dessa uppgifter, måste sädesceller vara beredd att möta en ständigt föränderlig miljö och att övervinna flera fysiska hinder. Att vara i huvudsak transkriptionellt och translationellt tyst, dessa rörliga celler förlitar djupt på olika signaleringsmekanismer att orientera sig och simma i en riktad mode, och att brottas med tuffa miljöförhållanden under sin resa för att hitta ägget. I synnerhet är Ca2 +-förmedlad signalering avgörande för flera spermier funktioner: aktivering av motilitet, capacitation (en komplex process som förbereder sperma för akrosomreaktionen) och akrosomreaktionen (en exocytotic händelse som gör att sperma-ägg smältning). Användningen av fluorescerande färger för att spåra intracellulära fluktuationer i denna jon är av anmärkningsvärd betydelse på grund av deras enkla ansökan, känslighet och mångsidighet DETektion. Använda en enda färg-lastning protokoll vi använder fyra olika fluorometriska tekniker för att övervaka sperm Ca2 + dynamik. Varje teknik ger tydlig information som gör det möjligt för rumslig och / eller temporal upplösning, generera data både vid enstaka cell och cellnivåer befolkning.

<img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figur 1. Skiss av det experimentella protokollet för spermier provberedning av uppsimningsförfarandet. De viktigaste stegen för separation av rörliga spermier och för anpassning av deras koncentration illustreras. Den sista inkubationssteg utförs endast när capacitation krävs. <p class="jove_content" fo:keep-...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell 

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging (Video) | JoVE

Intracellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamik är mycket viktiga i sperma fysiologi och Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Känsliga fluorescerande färgämnen utgör ett mångsidigt verktyg för att studera dem. Befolkning experiment (fluorometri och stoppade flödet fluorometri) och enstaka experiment cell (flödescytometri och enda cell imaging) används för att spåra tid och rum [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Förändringar i humana spermier.

Mätning intracellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Förändringar i mänskliga spermier med fyra tekniker: Konventionell fluorometri Stoppad Flow fluorometri, flödescytometri och Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm (Video) | JoVE

Tekniker för Imaging Ca 2 + Signalering i mänskliga spermier

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells (Video) | JoVE

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry (Video) | JoVE

Mätning Cell Kinetics cellcykelreglering med metabolisk märkning och flödescytometri

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes (Video) | JoVE

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry (Video) | JoVE

Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Äggcellen Cut-öppen vaselin Gap spänning-clamp teknik med fluorometri

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry (Video) | JoVE

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Flow Ã¢â‚¬â€ Combining Optogenetics with Flow Cytometry (Video) | JoVE

LED Thermo Flow - Kombinera optogenetik med flödescytometri

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry (Video) | JoVE

Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry (Video) | JoVE

Bedömning av autophagic Flux genom mätning av LC3-, p62- och LAMP1-co-lokalisering med användning av multispektral bildflödescytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts (Video) | JoVE

Mäta endoreduplikation av flödescytometri av isolerade Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...