Name: recombineering homologous recombination constructs in drosophila
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

ونود أن نشكر هوغو Bellen ومركز الأسهم بلومنجتون لالكواشف. نشكر مزيد كوين Venken، هوغو Bellen وجميع أعضاء مختبرات Buszczak وHiesinger لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة إلى ACR (T32GM083831)، PRH (RO1EY018884) وMB (RO1GM086647)، وهو منحة من الوقاية من السرطان معهد بحوث من تكساس إلى MB وPRH (RP100516)، وولش مؤسسة (I-1657) إلى PRH. MB هو EE وغرير غارسون Fogelson الباحث العلمي في أبحاث الطب الحيوي وPRH هو ماكديرموت الباحث يوجين في البحوث الطبية الحيوية في UT مركز ساوث ويسترن الطبي.

1. اختيار BAC ومن منطقة إلى استهداف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على BAC مع الجينات في المصالح (الحكومة العراقية) (هنا يتم استخدام CG32095 كمثال)، والبحث عن CG32095 في <a href="http://www.flybase.org" target="_blank">www.flybase.org</a> . تحت قسم الأسهم والكواشف، والتحقق م?...

<ol>
	<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila.">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila.">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li><li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ends-out,+or+replacement,+gene+targeting+in+Drosophila.">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+P[acman]+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster.">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila.">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li><li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families:+Rab+GTPases+as+a+case+study.">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li><li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells.">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li><li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+positive/negative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering.">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li></ol>

ويستند قوة الكائنات نموذج الجينية في مجال البحوث الطبية الحيوية إلى حد كبير على الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني. نماذج صغيرة C. ايليجانس وذبابة الفاكهة على وجه الخصوص تسمح للتحاليل وراثية جزيئية غير مكلفة وسريعة من مسارات كاملة وعائلات الجينات المتورطين في التن...

تنظيف التلاعب المعرفة جزيئيا من الجينات واحد في مواضع بهم الذاتية تقدم أداة لا تقدر بثمن لدراسة عدد لا يحصى من الأسئلة ذات الصلة لعلم الأحياء حقيقية النواة. ذبابة الفاكهة عكس التقنيات الوراثية لتوليد الأليلات الخسارة من وظيفة قد ثبت أن تكون صعبة حتى قدم [غليك] وزملاؤه في استهداف الجينات في الجسم الحي باستخدام إعادة التركيب مثلي لذبابة الفاكهة 1-3. وأظهروا أن يمكن استهداف مواضع الجيني محددة باستخدام جزء طولي من الحمض النووي من بناء متكامل المعدلة وراثيا. يتم إنشاء هذا خطي DNA &quot;المانحة&quot; في الجسم الحي من خلال إعادة التركيب FRT بوساطة (لاستئصال الحمض النووي من الكروموسوم كما جزيء دائري)، يليه الخطية مع meganuclease I-SCEI. على الرغم من أن هذه المنهجية استخدمت بنجاح لتوليد مجموعة متنوعة من الآفات محددة، ولم تكن هذه التقنية قابلة للتطوير بسهولة للتلاعب العديد من الجينات في نفس الوقت لأن كل indiviبناء خروج المغلوب المزدوج يتطلب تصميم متميز والعرف. على سبيل المثال، صعوبات في التلاعب بسلاسة شظايا كبيرة من الحمض النووي (&gt; 5 KB) في المختبر باستخدام الكلاسيكية تقييد انزيم / ربط استنساخ أو PCR، فضلا عن القيود التقليدية في حجم ناقلات تحول الجسم الحي في كثير من الأحيان تتداخل مع التولد السريع لإعادة التركيب مثلي استهداف ناقلات. للتغلب على هذه القيود، ونحن الجمع بين P [acman] نظام recombineering / نقل الجينات، والذي يسمح الفرعي الاستنساخ ونقل الجينات تصل إلى 100 كيلو بايت من الحمض النووي، مع استهداف نهايات المغادرة الجين منهجية لتأسيس منصة فعالة وسريعة نسبيا والتي يسهل استهداف الجين ذبابة الفاكهة. إعادة التركيب بوساطة الهندسة الوراثية (recombineering) هي قوية القائم على إعادة التركيب مثلي تكنولوجيا الاستنساخ 4،5. وعلى النقيض من التقليدية تقييد انزيم / يغاز الاستنساخ، recombineering لا يقتصر بواسطة تسلسل أو الاحجام(ه) من الحمض النووي التلاعب بها. يستخدم Recombineering لE. خاص سلالة القولونية التي تؤوي آلات إعادة التركيب التي يقدمها λ معيبة طليعة العاثية 4. وقد اعتمدت هذه التقنية مؤخرا لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 6،7. Recombineering في ذبابة الفاكهة تعتمد على amplifiable مشروط كروموسوم اصطناعي البكتيرية المعدلة (BAC) ناقلات دعا P [acman] 6،7. هذا ناقلات تحمل اثنين من أصل النسخ المتماثل: OriV، التي تنتج رقم ونسخة عالية على الاستقراء الكيميائية لتنقية كميات كبيرة من الحمض النووي المطلوبة لتسلسل وحقن الجنين وأوريس، التي تحافظ على رقم ونسخة منخفضة في ظل ظروف القاعدية. بالإضافة إلى ذلك، ف [acman] وقد تم تجهيز ناقلات مع المرفقات (attB) موقع البكتيرية. موقع attB بمثابة الركيزة لΦC31 integrase بوساطة نقل الجينات التي تسمح بإدماج شظايا الحمض النووي كبير في موقع الهبوط محددة سلفا داخل ذبابة الفاكهة الجينوم 8،9. لقد ولدت P [acman] ناقلات (المشار إليها باسم P [acman]-KO 1.0) التي يمكن استخدامها كناقل استهداف لغايات المغادرة مثلي إعادة التركيب 10،11. لدمج إنتهاء المغادرة استهداف الجينات التكنولوجيا في النظام، واضاف نحن اثنان FRT وموقعين I-SCEI. لقد تضمنت ايضا كاسيت بوابة ضمن هذه النواقل تعديل لتبسيط عملية دمج الأسلحة تناظر إلى P [acman]-KO 1.0. هذا يوفر وسيلة سريعة وبسيطة لإدخال عمليا أي منطقة الجيني من الفائدة في ناقلات الاستهداف. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح كيفية مهندس ناقلات استهداف باستخدام P [acman]-KO 1.0، وكيفية تعبئة هذه النواقل في الجسم الحي لاستهداف موضع الذاتية. لغرض هذا البروتوكول سوف نستخدم RFP / اساسه كاسيت ليحل محل الجينات في المصالح، ولكن مجموعة متنوعة من أشرطة الكاسيت التي تحتوي على علامة اختيار المضادات الحيوية يمكن استخدامها مع هذا البروتوكول. لقد قمنا بتصميم واستخدمت بنجاح مجموعة من أشرطة الكاسيت للاستبدال الجينات ووضع علامات 10،11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW102 Recombination competent bacteria</td>
			<td>NCI-Frederick</td>
			<td>Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)</td>
			<td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>EC300110</td>
			<td>Includes CopyControl induction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td>Aligent Technology Inc.</td>
			<td>600670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11789-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P[acman]KO1.010</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR RFP-Kan11</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystocks</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>Stock numbers: 25680, 25679</td>
			<td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 
			y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation machine</td>
			<td>Biorad GenePulser Xcell with PC module</td>
			<td>165-2662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>#FB101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombineering homologous recombination constructs in drosophila

سوف التطوير المستمر لتقنيات سريع، والتلاعب على نطاق واسع من مواضع الجينات الذاتية توسيع استخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن باعتباره النموذج الحي الوراثية للبحوث المتصلة الأمراض التي تصيب البشر. وقد شهدت السنوات الأخيرة التقدم التقني مثل إعادة التركيب مثلي وrecombineering. ومع ذلك، وتوليد الطفرات باطل لا لبس فيه أو البروتينات الذاتية علامات يبقى جهدا كبيرا لمعظم الجينات. هنا، نحن تصف وشرح تقنيات واستخدام أساليب الاستنساخ القائم على recombineering لتوليد نواقل التي يمكن استخدامها لاستهداف ومعالجة مواضع الذاتية في الجسم الحي على وجه التحديد، وقد أنشأنا مجموعة من ثلاث تقنيات: (1) نقل الجينات BAC / recombineering، ( 2) تنتهي إجراءات المغادرة مثلي إعادة التركيب و (3) التكنولوجيا بوابة لتوفير وسيلة قوية وفعالة ومرنة لمعالجة مواضع الجيني الذاتية. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم التفاصيل خطوة بخطوة حول كيفية (1) تصميم individuaناقلات لتر، (2) كيفية استنساخ شظايا كبيرة من الحمض النووي الجيني في ناقلات إعادة التركيب مثلي باستخدام إصلاح الفجوة، و (3) كيفية استبدال أو علامة الجينات في المصالح داخل هذه النواقل باستخدام الجولة الثانية من recombineering. وأخيرا، فإننا نقدم أيضا بروتوكول لكيفية تعبئة هذه الأشرطة في الجسم الحي لتوليد بالضربة القاضية، أو الجينات المرتبطة دلاليا عبر الضربة القاضية في. ويمكن بسهولة أن اعتمدت هذه الأساليب لأهداف متعددة في نفس الوقت وتوفير وسيلة لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة.

التضخيم من LA والأسلحة تناظر RA يجب أن ينتج 500 منتجات BP ورد فعل PCR-الشركات المملوكة للدولة يجب أن تسفر عن 1.0 كيلوبايت المنتج (2،1-2،4 أقسام؛ الشكل 2). رد فعل BP أجريت في القسم 2.5 هو عادة تحول فعالة جدا والبكتيرية من غلة المنتج 5-100 المستعمرات في المتوسط. ما يقرب من جميع م...

Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

مثلي تقنيات إعادة التركيب تقدم كبير<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; علم الوراثة من خلال تمكين إنشاء الطفرات دقيقة جزيئيا. اعتماد الأخيرة من recombineering يسمح احد للتلاعب قطعة كبيرة من الحمض النووي وتحويلها إلى<em&gt; ذبابة الفاكهة</em<sup&gt; 6</sup&gt;. الأساليب المقدمة هنا الجمع بين هذه التقنيات لتوليد بسرعة كبيرة مثلي ناقلات إعادة التركيب.

Recombineering مثلي التركيبات التوحد في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

الولبخية عدوى بكتيرية في ذبابة الفاكهة

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

تلفيق عضلي يبني الأنسجة المهندسة

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...