Name: recombineering homologous recombination constructs in drosophila
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

私たちは、ヒューゴBellenと試薬用ブルーミントンストックセンターに感謝したいと思います。我々はさらに有用な議論のために公園Venken、ヒューゴBellenとBuszczakとHiesingerラボのすべてのメンバーに感謝します。この作品は、ACRの国立衛生研究所（T32GM083831）、PRH（RO1EY018884）からの補助金によってとMB（RO1GM086647）、MBとPRH（RP100516）にテキサス州のがん予防研究所によって助成金、およびウェルチにサポートされていましたPRHへ財団（I-1657）。 MBは、生物医学研究におけるEEとグリア·ガーソンFogelson大学者で、PRHは、UTの南西医療センターの生物医学研究におけるユージンマクダーモット学者です。

1。ターゲットへのBACと地域の選択<ol><li>目的の遺伝子（GOI）（ここでCG32095を例として使用されている）、でCG32095の検索でBACを取得する<a href="http://www.flybase.org" target="_blank">www.flybase.org</a> 。セクションの株式や試薬の下では、CG32095を含むBACをするため、 &quot;ゲノムクローン&quot;と題するセクションを確認してください。 BACは、少なくとも10キロバイト、上流と5キロバ?...

<ol>
	<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila.">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila.">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li><li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ends-out,+or+replacement,+gene+targeting+in+Drosophila.">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+P[acman]+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster.">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila.">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li><li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families:+Rab+GTPases+as+a+case+study.">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li><li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells.">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li><li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+positive/negative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering.">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li></ol>

生物医学研究における遺伝的モデル生物の力は、主に遺伝子操作のために利用可能なツールに基づいています。小さ ​​なモデルC.特に虫とショウジョウバエは、多細胞発達や機能に関与して、完全な経路および遺伝子ファミリーの、安価で高速な分子遺伝学的解析が可能になります。近年は、 ショウジョウバエ 14,15の遺伝子を操作するためのツールの開?...

彼らの内因性遺伝子座にある単一の遺伝子の分子的に定義された操作をきれいにすることは、真核生物に関連する質問の無数を研究するための貴重なツールを提供しています。 ショウジョウバエは、機能喪失対立遺伝子を生成するための遺伝学的手法を逆Golicと同僚に導入するまで挑戦することが証明されていた生体内遺伝子はショウジョウバエ 1-3に相同組換えを利用したターゲット。彼らは、その特定のゲノム遺伝子座が統合トランスジェニック構築物からのDNAの線状断片を用いて標的を実証することができる。この線形&quot;ドナー&quot; DNAはメガヌクレアーゼI-SceIを持つ線形続いFRT媒介組換え（物品税に環状分子として染色体からDNA）を通して生体内で生成されます。この方法は正常に定義された病変の様々を生成するために使用されているが、この技術は、並列で多数の遺伝子を操作するために容易に拡張されていないため、各INDIVIデュアルノックアウトコンストラクトははっきりとカスタム設計を必要とします。シームレスクラシカル制限酵素/ライゲーションクローニングやPCRならびに生体形質転換ベクターの伝統のサイズ制限はしばしば標的相同組換えの迅速な作成に干渉を用いたin vitroでの DNAの大断片（&gt; 5 KB）を操作することで例えば、困難ベクトル。これらの制限を克服するために、我々はそれを効率的かつ比較的急速なプラットフォームを確立するための方法論をターゲット両端アウト遺伝子とDNAの100キロバイトまでのサブ·クローニングと遺伝子導入を可能にしますコンビニアリング/トランスジェネシスP [acman]システムを、組み合わせショウジョウバエの遺伝子ターゲティングが容易になります。 組み換え媒介遺伝子工学（コンビニアリング）は4,5パワフル相同組換えベースのクローン技術です。従来の制限酵素/リガーゼクローニングとは対照的に、コンビは、シーケンスまたはSIZに限定されるものではない操作したDNAの電子。コンビニアリングは、特別なE.を使用しています不良λプロファージ4で提供される組換え機構を宿す大腸菌株 。この技術は、最近ショウジョウバエ 6,7に採用されている。 ショウジョウバエのコンビニアリングはP [acman] 6,7と呼ばれる修正された条件に応じて増幅細菌人工染色体（BAC）ベクターに依存しています。 ORIV、シーケンシングおよび胚の注入および基底条件下で低コピー数を維持オリスに必要なDNAの大量の精製のための化学誘導時に高コピー数を生成します。このベクターは、複製の二起源を運ぶ。さらに、P [acman]ベクターは細菌の付着（のattB）サイトが装備されています。のattBサイトは、 ショウジョウバエのゲノム8,9内の所定の着陸地点に大きなDNA断片の取り込みを可能にΦC31インテグ媒介形質転換のための基質として機能します。 我々は、両端アウト相同組換え10,11のためのターゲティングベクターとして使用することができるP [acman]ベクトル（P [acman]-KO 1.0と呼ぶ）が生成されている。システムに技術をターゲット両端アウト遺伝子組み込むには、我々は2つ​​のFRTと2 I-SceI制限酵素サイトを追加しました。また、P [acman]-KO 1.0にホモロジーアームを組み込むプロセスを合理化するために、この修正されたベクター内のゲートウェイカセットが含まれている。これは、ターゲティングベクターに関心の事実上すべてのゲノム領域を導入するための迅速かつ簡単な方法を提供します。このプロトコルでは、P [acman]-KO 1.0、そしてどのように内因性遺伝子座を標的とするin vivoでこのベクトルを動員するを使用してターゲティングベクターを設計する方法について説明します。このプロトコルの目的のために、我々は、目的の遺伝子を置換するRFP /菅カセットを使用するが、抗生物質選択マーカーを含有するカセットの様々なこのプロトコルで使用することができる。私たちは、カセットのセットのために設計されており、正常に使用している遺伝子置換およびタギング10,11。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW102 Recombination competent bacteria</td>
			<td>NCI-Frederick</td>
			<td>Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)</td>
			<td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>EC300110</td>
			<td>Includes CopyControl induction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td>Aligent Technology Inc.</td>
			<td>600670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11789-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P[acman]KO1.010</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR RFP-Kan11</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystocks</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>Stock numbers: 25680, 25679</td>
			<td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 
			y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation machine</td>
			<td>Biorad GenePulser Xcell with PC module</td>
			<td>165-2662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>#FB101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombineering homologous recombination constructs in drosophila

内因性遺伝子座の高速、大規模な操作のための技術の継続的な開発は、ヒトの疾患関連の研究のための遺伝モデル生物としてキイロショウジョウバエの使用を広げるする。近年では、相同組換えとコンビニアリングなどの技術的な進歩を見てきました。しかし、明確なヌル突然変異またはタギング内因性タンパク質を生成することはほとんどの遺伝子のために相当な努力のまま。ここでは、 インビボで内因性遺伝子座を標的とし、操作するために使用することができるベクターを生成するためにコンビベースのクローニング方法を使用するための技術を記述し、実証具体的には、3つの技術の組み合わせを確立している：（1）BACの形質転換/コンビ、（ 2）端部アウト相同組換えおよび（3）ゲートウェイ技術は、内因性遺伝子座を操作するための堅牢な、効率的で柔軟な方法を提供することにある。このプロトコルでは、我々はどのように（1）設計individuaの約ステップバイステップの詳細を提供Lベクトルは、（2）ギャップの修復を使用して相同組換えベクターにゲノムDNAの大断片のクローンを作成する方法、および（3）コンビニアリングの第二ラウンドを使用して、これらのベクター内に目的の遺伝子を交換するか、タグにどのように。最後に、我々はまた、ノックアウト、またはノックイン経由タグ付けされた遺伝子を生成するために、生体内でこれらのカセットを動員する方法のためのプロトコルを提供する。これらの方法は、簡単に並列に複数のターゲットを採用し、タイムリーかつ効率的にショウジョウバエのゲノムを操作するための手段を提供することができます。

LAやRAのホモロジーアームの増幅は500 bpの製品を生産する必要がありますし、PCR-SOE反応が1.0キロバイト製品（セクション2.1から2.4、 図2）を得る必要があります。セクション2.5で実行BP反応は、通常、製品の歩留まり平均で5-100コロニーの非常に効率的で、細菌の変換です。ほぼPCR検査で試験したすべてのコロニーは、予想されるPCR産物を示す。 コンビニアリ...

Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

相同組換え技術は大きく前進<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;分子正確な突然変異の作成を可能にすることによって、遺伝学。コンビニアリングの最近の採用は1つがDNAの大部分を操作し、にそれらを変換することができます<em&gt;ショウジョウバエ</em<sup&gt; 6</sup&gt;。方法は、急速に大規模な相同組換えベクターを生成するためにこれらの技術を組み合わせて、ここで提示した。

における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変<em&gt;ショウジョウバエ</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

ショウジョウバエにおけるボルバキア細菌感染

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

筋原培養組織コンストラクトの作製

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...