Name: recombineering homologous recombination constructs in drosophila
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

Vi ønsker å takke Hugo Bellen og Bloomington Stock Center for reagenser. Vi videre takke Koen Venken, Hugo Bellen og alle medlemmer av Buszczak og Hiesinger laboratorier for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) og MB (RO1GM086647), et stipend ved Cancer Prevention Research Institute of Texas til MB og PRH (RP100516), og Welch Foundation (I-1657) til PRH. MB er en EE og Greer Garson Fogelson Scholar i biomedisinsk forskning og PRH er en Eugene McDermott Scholar i biomedisinsk forskning ved UT Southwestern Medical Center.

En. Valg av BAC og regionen til Target <ol><li> Å skaffe seg en BAC med genet av interesse (GOI) (her CG32095 brukes som et eksempel), søk etter CG32095 på <a href="http://www.flybase.org" target="_blank">www.flybase.org</a> . Under avsnittet aksjer og reagenser, sjekk avsnittet, &quot;Genomiske Clones&quot; for BACS inneholder CG32095. Kontroller at BAC inkluderer minst 10 kb oppstrøms og 5 kb nedstrøms genet av interesse. Alternativt kan kloner i P [ACMAN] vektor 7 også bl...

<ol>
	<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila.">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila.">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li><li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ends-out,+or+replacement,+gene+targeting+in+Drosophila.">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+P[acman]+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster.">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila.">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li><li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families:+Rab+GTPases+as+a+case+study.">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li><li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells.">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li><li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+positive/negative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering.">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li></ol>

Kraften av genetiske modellorganismer i biomedisinsk forskning er i stor grad basert på de verktøyene som er tilgjengelige for genetisk manipulasjon. De små modeller C. elegans og Drosophila spesielt tillate for billig og rask molekylærgenetiske analyser av komplette stier og genet familier innblandet i flercellede utvikling eller funksjon. Siste årene har sett betydelige fremskritt innen verktøy utvikling for å manipulere gener i Drosophila 14,15. For eksempel ble recombinee...

Rengjør molekylært-definerte manipulasjoner av single gener på deres endogene loci tilby et uvurderlig verktøy for å studere et mylder av spørsmål som er relevante for eukaryote biologi. Reversere Drosophila genetiske teknikker for å generere tap-av-funksjon alleler hadde vist seg å være utfordrende til Golić og kolleger introdusert i vivo gene targeting bruke homolog rekombinasjon til Drosophila 1-3. De viste at bestemte genomiske loci kan man ved å bruke et lineært fragment av DNA fra et integrert transgen konstrukt. Denne lineære &quot;donor&quot; DNA er generert in vivo ved FRT-mediert rekombinasjon (å skjære DNA fra kromosomet som et sirkulært molekyl) etterfulgt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Selv om denne metoden har blitt brukt til å generere et antall definerte lesjoner, har teknikken ikke vært lett skalerbar for manipulering av mange gener i parallell fordi hvert enkeltdual knockout konstruere krever tydelig og tilpasset design. For eksempel, vanskeligheter sømløst manipulere store fragmenter av DNA (&gt; 5 kb) in vitro ved bruk av klassisk restriksjonsenzym / ligering kloning eller PCR, samt størrelse begrensninger på tradisjonell in vivo transformasjon vektorer ofte i konflikt med rask etablering av homolog rekombinasjon målretting vektorer. For å overvinne disse begrensninger kombinerte vi den recombineering / transgenesis P [ACMAN]-system, som tillater den sub-kloning og transgenesis på opptil 100 kb av DNA, med endene ut-genet targeting metode for å etablere en effektiv og relativ rask plattformen forenkler Drosophila gene targeting. Rekombinasjon-mediert genteknologi (recombineering) er en kraftig homolog rekombinasjon-baserte kloning teknologi 4,5. I motsetning til konvensjonelle restriksjonsenzym / ligase kloning, er recombineering ikke begrenset av sekvensen eller size av den manipulerte DNA. Recombineering bruker en spesiell E. coli stamme som havner rekombinasjon maskiner levert av en defekt λ prophage fire. Denne teknikken har nylig blitt tatt i bruk i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila er avhengig av en modifisert betinget amplifibart bakteriell kunstig kromosom (BAC) vektor kalt P [ACMAN] 6,7. Dette vektor bærer to opprinnelsen til replikering: OriV, som produserer high-kopi nummer etter kjemisk induksjon for rensing av store mengder DNA som kreves for sekvensering og embryo injeksjon og åpninger, som opprettholder lav-kopi nummer under basale forhold. I tillegg, P [ACMAN] vektor er utstyrt med en bakteriell tilknytningssted (attB) område. Den attB området fungerer som et substrat for ΦC31 integrase-mediert transgenesis som gjør at inkorporering av store DNA-fragmenter til en forhåndsbestemt landingssted i Drosophila genom 8,9. Vi har generert en P [ACMAN] vektor (referert til som P [ACMAN]-KO 1,0) som kan bli brukt som en målsøkende vektor for-ender ut homolog rekombinasjon 10,11. Å innlemme ender ut gene targeting teknologi inn i systemet, la vi to FRT og to I-SCEI nettsteder. Vi har også inkludert en Gateway kassett innenfor denne modifiserte vektor for å effektivisere prosessen med å innlemme de homologidomene armene i P [ACMAN]-KO 1.0. Dette gir en hurtig og enkel måte å innføre praktisk talt en hvilken som helst genomisk region av interesse i målrettingsverdien vektor. I denne protokollen vil vi beskrive hvordan du ingeniør en målretting vektor ved hjelp av P [ACMAN]-KO 1.0, og hvordan å mobilisere denne vektor in vivo å målrette den endogene locus. For formålet med denne protokollen vil vi bruke RFP / Kan kassett som erstatter et gen av interesse, men en rekke kassetter som inneholder et antibiotikum seleksjonsmarkør kan brukes med denne protokoll. Vi har designet og hell brukt et sett med kassetter forgenet utskifting og tagging 10,11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW102 Recombination competent bacteria</td>
			<td>NCI-Frederick</td>
			<td>Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)</td>
			<td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>EC300110</td>
			<td>Includes CopyControl induction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td>Aligent Technology Inc.</td>
			<td>600670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11789-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P[acman]KO1.010</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR RFP-Kan11</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystocks</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>Stock numbers: 25680, 25679</td>
			<td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 
			y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation machine</td>
			<td>Biorad GenePulser Xcell with PC module</td>
			<td>165-2662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>#FB101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombineering homologous recombination constructs in drosophila

Den videre utviklingen av teknikker for rask, storskala manipulering av endogene genloci vil utvide bruken av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organisme for human-sykdom forskning. De siste årene har tekniske fremskritt som homolog rekombinasjon og recombineering. Men generere entydige null mutasjoner eller tagging endogene proteiner fortsatt en betydelig innsats for de fleste gener. Her beskriver vi og demonstrerer teknikker for bruk av recombineering-baserte metoder for kloning for å generere vektorer som kan brukes for å målrette og manipulere endogene loci in vivo Konkret er det etablert en kombinasjon av tre forhold: (1). BAC transgenesis / recombineering, ( 2) ender ut homolog rekombinasjon og (3) Gateway teknologi for å gi en robust, effektiv og fleksibel metode for å manipulere endogene genomisk loci. I denne protokollen, gir vi trinn-for-trinn detaljer om hvordan du (1) utforming individual vektorer, (2) hvordan å klone store fragmenter av genomisk DNA inn i homolog rekombinasjon vektor ved hjelp av gap reparasjon, og (3) hvordan å erstatte eller merke gener av interesse innenfor disse vektorer ved hjelp av en ny runde med recombineering. Til slutt vil vi også gi en protokoll for hvordan å mobilisere disse kassetter in vivo for å generere en knockout, eller en merket genet via knock-in. Disse metodene kan lett bli vedtatt for flere mål i parallell og gi et middel for å manipulere Drosophila genomet på en riktig og effektiv måte.

Forsterkning av LA og RA homologidomene armene skal produsere 500 bp produkter og PCR-SOE reaksjon bør gi en 1,0 kb produkt (§ § 2.1 til 2.4, figur 2). BP reaksjon utført i avsnitt 2.5 er vanligvis svært effektiv og bakteriell transformasjon av produktet gir 5-100 kolonier i gjennomsnitt. Nesten alle koloniene testet med PCR sjekk viser det forventede PCR produktet. I løpet av den første runden av recombineering (§ 3) forventer å få 20-40 kolonier etter transformas...

Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homolog rekombinasjon teknikker sterkt fremme<em&gt; Drosophila</em&gt; Genetikk ved å muliggjøre etableringen av molekylært presise mutasjoner. Den nylige innføringen av recombineering gjør det mulig å manipulere store biter av DNA og forvandle dem til<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. Metodene som presenteres her kombinere disse teknikkene til å raskt generere store homolog rekombinasjon vektorer.

Recombineering homolog rekombinasjon konstruerer i<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genmodifisering og Rekombinasjon av spyttkjertel Organ kulturer

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Tilberedning av Mgm101 rekombinasjon Protein av MBP-baserte Tagging Strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...