Name: recombineering homologous recombination constructs in drosophila
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

Vi vill tacka Hugo Bellen och Bloomington Stock Centrum för reagenser. Vi tackar ytterligare Koen Venken, Hugo Bellen och alla medlemmar i Buszczak och Hiesinger labb för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) och MB (RO1GM086647), ett bidrag från Cancer Prevention Research Institute of Texas till MB och PRH (RP100516), och Welch Foundation (I-1657) till PRH. MB är en EE och Greer Garson Fogelson Scholar i biomedicinsk forskning och PRH är en Eugene McDermott Scholar i biomedicinsk forskning vid UT Southwestern Medical Center.

Ett. Val av BAC och region till Target <ol><li> Att skaffa sig en BAC med genen av intresse (indiska) (här CG32095 används som exempel), sök efter CG32095 på <a href="http://www.flybase.org" target="_blank">www.flybase.org</a> . Under avsnittet bestånden och reagenser, kontrollera avsnittet, &quot;genomiska kloner&quot; för BAC innehåller CG32095. Kontrollera att BAC omfattar minst 10 kb uppströms och 5 kb nedströms genen av intresse. Alternativt, kan kloner i P [acman] vektor ...

<ol>
	<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila.">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila.">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li><li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ends-out,+or+replacement,+gene+targeting+in+Drosophila.">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics.">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li><li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[acman]:+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster.">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+P[acman]+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster.">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li><li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31.">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila.">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li><li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families:+Rab+GTPases+as+a+case+study.">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li><li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells.">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li><li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+positive/negative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering.">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li><li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster.">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li></ol>

Kraften av genetiska modellorganismer inom biomedicinsk forskning i stor utsträckning bygger på de verktyg som finns för genetisk manipulation. De små modellerna C. elegans och Drosophila framför allt möjliggöra billiga och snabba molekylärgenetiska analyser av kompletta banor och familjer gen inblandad i flercellulär utveckling eller funktion. De senaste åren har sett betydande framsteg i utvecklingen av verktyg för att manipulera gener i Drosophila 14,15. Till exempel v...

Rengör molekylärt definierade manipulationer av enstaka gener hos deras endogena loci erbjuder ett ovärderligt verktyg för att studera en myriad av frågor av betydelse för eukaryot biologi. Drosophila omvända genetiska tekniker för att generera förlust av funktion alleler hade visat sig vara utmanande tills Golic och kollegor infördes vivo genmålsökning använder homolog rekombination till Drosophila 1-3. De visade att specifika genomiska loci kan riktas med hjälp av ett linjärt fragment av DNA från en integrerad transgen konstruktion. Denna linjära &quot;donator&quot; DNA genereras in vivo genom FRT-medierad rekombination (för att skära ut DNA från kromosomen som en cirkulär molekyl) följt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Även om denna metod har använts för att generera ett antal olika definierade lesioner har tekniken inte varit lätt skalbara för manipulering av ett stort antal gener parallellt, eftersom varje enskilddubbla knockoutkonstruktet kräver distinkt och egen design. Till exempel, svårigheter att sömlöst manipulera stora fragment av DNA (&gt; 5 kb) in vitro med användning av klassisk restriktionsenzym / lige kloning eller PCR, samt de begränsningar storleken av traditionell in vivo transformationsvektorer stör ofta med att snabbt skapa homolog rekombination inriktning vektorer. För att övervinna dessa begränsningar, kombinerat vi recombineering / transgenes P [acman] systemet, vilket gör att sub-kloning och genmodifiering av upp till 100 kb av DNA, med ändarna ut genmålinriktning metodik för att skapa en effektiv och relativt snabb plattform som underlättar Drosophila genmålsökning. Rekombination-medierad genetisk ingenjörskonst (recombineering) är en kraftfull homolog rekombination-baserad kloning teknik 4,5. I motsats till konventionell restriktionsenzym / ligas kloning, är recombineering inte begränsad av en gensekvens eller size av manipulerade DNA. Recombineering använder en speciell E. coli-stam som härbärgerar rekombination maskiner från en defekt λ profag 4. Denna teknik har nyligen antagits för användning i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila bygger på en modifierad villkorligt amplifierbar bakteriell artificiell kromosom (BAC) vektor kallas P [acman] 6,7. Denna vektor bär två replikationsursprung: oriV, som producerar högt-kopietal vid kemisk induktion för rening av stora mängder av DNA som krävs för sekvensering och embryo injektionen och oris, som upprätthåller låg-kopietal enligt basala förhållanden. Dessutom P [acman] vektor är utrustad med en bakteriell infästning (attB)-ställe. Den attB-ställe fungerar som ett substrat för ΦC31 integras-förmedlad transgenes som tillåter inkorporering av stora DNA-fragment till en förutbestämd landningsplats inom Drosophila genomet 8,9. Vi har genererat en P [acman] vektor (kallat P [acman]-KO 1.0) som kan användas som en målsökande vektor för slutar-out homolog rekombination 10,11. Att införliva ändar ut genmålinriktning teknik i systemet, har vi lagt två FRT och två I-SCEI webbplatser. Vi har även inkluderat en Gateway kassett inom denna modifierade vektor för att effektivisera processen för att införliva homologiarmarna i P [acman]-KO 1.0. Detta ger ett snabbt och enkelt sätt att införa praktiskt taget vilken genomisk region av intresse i den målsökande vektorn. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur man kan konstruera en målsökande vektor med P [acman]-KO 1.0, och hur man kan utnyttja denna vektor in vivo för att rikta den endogena lokus. För detta protokoll kommer vi att använda RFP / Kan kassett för att ersätta en gen av intresse, men en mängd olika kassetter som innehåller ett antibiotikum selektionsmarkör kan användas med detta protokoll. Vi har designat och framgångsrikt använt en uppsättning kassetter förgenersättning och taggning 10,11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW102 Recombination competent bacteria</td>
			<td>NCI-Frederick</td>
			<td>Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)</td>
			<td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>EC300110</td>
			<td>Includes CopyControl induction solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td>Aligent Technology Inc.</td>
			<td>600670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11789-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P[acman]KO1.010</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR RFP-Kan11</td>
			<td>Buszczak and Hiesinger Labs</td>
			<td>Upon request</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystocks</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>Stock numbers: 25680, 25679</td>
			<td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 
			y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation machine</td>
			<td>Biorad GenePulser Xcell with PC module</td>
			<td>165-2662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>#FB101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombineering homologous recombination constructs in drosophila

Den fortsatta utvecklingen av tekniker för snabb, storskalig manipulering av endogena genloci kommer att bredda användningen av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organism för human-sjukdom relaterad forskning. De senaste åren har tekniska framsteg som homolog rekombination och recombineering. Dock genererar entydiga null mutationer eller tagga proteiner endogena fortfarande en betydande insats för de flesta gener. Här beskriver vi och demonstrera tekniker för att använda recombineering-baserade kloning metoder för att generera vektorer som kan användas för att rikta och manipulera endogena loci in vivo Specifikt har vi etablerat en kombination av tre tekniker:. (1) BAC transgenes / recombineering, ( 2) ändar ut homolog rekombination och (3) Gateway teknik för att ge en robust, effektiv och flexibel metod för att manipulera endogena genomiska loci. I detta protokoll, ger vi steg-för-steg-information om hur du (1) utformning individual vektorer, (2) hur man klona stora fragment av genomisk DNA i homolog rekombination vektor gap-reparation, och (3) hur man kan ersätta eller tagga gener av intresse inom dessa vektorer med hjälp av en andra omgång av recombineering. Slutligen ger vi också ett protokoll för hur man kan utnyttja dessa kassetter in vivo för att generera en knockout, eller en taggad gen via knock-in. Dessa metoder kan lätt anpassas till flera mål parallellt och ger ett medel för att manipulera Drosophila genomet i ett snabbt och effektivt sätt.

Förstärkning av LA och RA homologiarmar ska producera 500 bp produkter och PCR-SOE reaktion bör ge en 1,0 kb produkten (avsnitten 2.1-2.4, Figur 2). BP reaktionen i avsnitt 2.5 är normalt mycket effektiv och bakteriell omvandling av produktutbytena 5-100 kolonier i genomsnitt. Nästan alla kolonier testades med PCR kolla visar den förväntade PCR-produkten. Under den första omgången av recombineering (avsnitt 3) räkna med att få 20-40 kolonier efter omvandlingen av ...

Watch this Scientific Journal Video about Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila at JoVE.com

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homolog rekombination tekniker avancera kraftigt<em&gt; Drosophila</em&gt; Genetik genom att möjliggöra skapandet av molekylärt exakta mutationer. Den nyligen antagna recombineering gör att man kan manipulera stora bitar av DNA och omvandla dem till<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. De metoder som presenteras här kombinera dessa tekniker att snabbt generera stora homologa rekombinationsvektorer.

Recombineering homolog rekombination Konstruktionerna i<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

Wolbachia bakterieinfektion i Drosophila

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Tillverkning av Myogenic vävnadstekniska Konstruerar

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofysiologiska Inspelning i Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Produktionen av C. elegans Transgener via Recombineering med GalK Markör

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Identifiera Effekter av BRCA1 mutationer på homolog rekombination med hjälp av celler som uttrycker Endogent vildtyp-BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetisk modifiering och rekombination av saliv kulturer Gland Organ

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Beredning av Mgm101 rekombinationsprotein av MBP-baserade taggning strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...