Name: in vivo imaging of tumor angiogenesis using fluorescence confocal videomicroscopy
Uploaded: 2013-09-11T14:30:00
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1. Herstellung des Kontrastmittels <ol><li> Für FITC-Dextran 70 kDa, die injizierten Dosis ist 500 mg / kg (10 mg FITC-Dextran in 0,1 ml Kochsalzlösung für eine Maus mit einem Gewicht von 20 g verdünnt). </li><li> Das Mittel sollte nicht zu lange ausgesetzt werden, um Licht. Bleich zu vermeiden, empfiehlt es sich, das Röhrchen mit Aluminiumfolie abzudecken. </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung von 1:4 von Xylazin (Rompun 2%...

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	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+concepts+of+the+angiogenic+process.">Fundamental concepts of the angiogenic process.</a> Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).</li><li>Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+confocal+fluorescence+microscopy+(Cell-viZio)+facilitates+extended+imaging+in+the+field+of+microcirculation.+A+comparison+with+intravital+microscopy.">Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy.</a> J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).</li><li>Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+angiogenesis.">Imaging angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).</li><li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contrast+enhanced+optical+imaging+of+capillary+leakage.">Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage.</a> Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).</li><li>Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+nitric+oxide+production.+Mechanisms+of+vascular+albumin+leakage.">Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage.</a> Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).</li><li>Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+capillary+leakage+is+involved+in+the+onset+of+anaphylactic+hypotension.">Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension.</a> Anesthesiology. , (2012).</li><li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).</li><li>Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+tumour+blood+vessels.">Disrupting tumour blood vessels.</a> Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).</li><li>Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+antitumor+treatment+by+means+of+fluorescence+molecular+tomography+with+an+annexin+V-Cy5.5+conjugate.">Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).</li><li>Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+optical+contrast+agent+dynamics+in+rat+tumors+by+use+of+diffuse+optical+spectroscopy+with+magnetic+resonance+imaging+coregistration.">In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration.</a> Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).</li></ol>

Die Untersuchung der Tumormikrozirkulation unverzichtbar geworden für das Verständnis der Pathophysiologie von Tumorwachstum, Verbreitung und Ansprechen auf die Therapie ein. Optisches Abbildungs ​​ist eine der Techniken, die verwendet werden können, um die Kapillaren zu beobachten unter Verwendung eines fluoreszierenden Kontrastmittels und morphologischen (funktionelle Kapillardichte) und funktionellen (Index Leckage) Parameter zu quantifizieren. Die Fluoreszenz Mikroskopi...

Angiogenese ist ein komplexer Prozess 1, die die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits vorhandenen Fahrzeugen beinhaltet. Pathologische Veränderungen im Gewebe Mikrozirkulation, von Arteriolen, Kapillaren und Venen besteht, sind in einer großen Palette von Krankheiten, wie Krebs, Entzündungen oder Diabetes in Verbindung gebracht. Es ist daher wichtig, Methoden zu quantitativ beurteilen Mikrogefäßstruktur und-funktion zu entwickeln. Bildgebung ermöglicht die Untersuchung von Mikrogefäßen in einem nicht-oder mikroinvasive Weise in Echtzeit und in vivo und wiederholten Messungen im Laufe der Zeit in dem gleichen Tier 2. Derzeit wird die dynamische kontrastverstärkte (DCE) Bild 3 häufig verwendet, um Gewebe-Mikrozirkulation zu beurteilen. Dynamischen kontrastverstärkten Bildgebung ist eine Technik, die im Laufe der Zeit die Bioverteilung eines Tracers intravenös injiziert folgt. Von dieser Übernahme kann quantitative Parameter extrahiert reflektierende Gewebe Gefäß werden. DCE-Bildgebungwurde am häufigsten mit CT, MRT oder Ultraschall verwendet werden. Allerdings sind diese bildgebenden Verfahren nicht zulassen, dass die direkte Betrachtung der Mikrogefäße, da ihre Auflösung, anders als bei der Verwendung von bestimmten experimentelle Geräte bleibt meist makroskopische. In diesem Papier, schlagen wir vor, das Gefäßsystem des Tumors auf der mikroskopischen Skala und in vivo-Studie mit dynamischen kontrastverstärkten optischen Bildgebung, mit fibered konfokalen Videomikroskopie. Wir verwendeten eine makromolekulare Kontrastmittel (FITC-Dextran), die ausschließlich in Behältern oder Lecks durch die endotheliale Schranke in das Interstitium bleibt, nach seinem Molekulargewicht und die Eigenschaften des Endothels der untersuchten Gewebe 4. Dies ermöglichte die Untersuchung der beiden Mikrogefäßstruktur, durch die korrekte Abgrenzung Gefäße und Durchlässigkeit der Kapillaren, durch auslaufende und der sich in das Interstitium.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin serynge 
 Myjector 1ml 
 29G</td>
 <td>Terumo Europe </td>
 <td>BS-05M2913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>01619HH</td>
 <td>100 mg/mL 
 diluted in saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibered confocal videomicroscopy</td>
 <td>Cellvizio - MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>LSU-488</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probe ProFlexTM Z</td>
 <td>MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mosaicing software</td>
 <td>MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vessel detection software</td>
 <td>MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo imaging of tumor angiogenesis using fluorescence confocal videomicroscopy

Fibered konfokalen Fluoreszenz in-vivo-Bildgebung mit einem Faseroptikbündel verwendet das gleiche Prinzip wie Fluoreszenz konfokalen Mikroskopie. Es kann Fluoreszenz-in situ-Elemente durch die optischen Fasern zu erregen, und dann erfassen einige der emittierten Photonen, über den gleichen optischen Fasern. Die Lichtquelle ist ein Laser, der das Anregungslicht durch ein Element innerhalb des Faserbündels sendet und wie es über die Probe scannt, erstellt ein Bild Pixel für Pixel. Da diese Überprüfung ist sehr schnell, indem sie mit speziellen Bildverarbeitungssoftware können die Bilder in Echtzeit mit einer Frequenz von 12 Bildern / sec erhalten werden. Wir entwickelten eine Technik, um quantitativ zu charakterisieren Kapillare Morphologie und Funktion mit einem konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie Gerät. Der erste Schritt in unserem Experiment wurde auf 5 sec Filme aufnehmen in den vier Quadranten des Tumors, die kapillare Netzwerk visualisieren. Alle Filme wurden mit einer Software verarbeitet (ImageCell, Mauna Kea Technologie, Paris), die eine automatische Segmentierung von Schiffen zu einem gewählten Durchmesser (10 um in unserem Fall) führt. So konnten wir die funktionalen Kapillardichte &quot;, die das Verhältnis zwischen der gesamten Gefäßfläche und der Gesamtfläche des Bildes zu quantifizieren. Dieser Parameter war ein Surrogatmarker für die mikrovaskuläre Dichte, mit der Pathologie Tools in der Regel gemessen. Der zweite Schritt war, um Filme des Tumors aufnehmen über 20 Minuten, um ein Auslaufen der makromolekularen Kontrastmittel durch die Kapillarwand in das Interstitium zu quantifizieren. Durch Messung des Verhältnisses der Signalintensität im Interstitium gegenüber der in den Behältern wurde eine Index Leckage &quot;erhalten wird, als Surrogatmarker für die Durchlässigkeit der Kapillaren wirkt.

Verwendung der gesammelten Daten, könnten wir verschiedene Parameter quantitativ zu analysieren reflektierenden Mikrozirkulation. Wir untersuchten in vivo die periphere Gefäßnetz eines Darmtumors in Balb-c-Mäuse mit einem konfokalen Fluoreszenzvideomikroskopie fibered System (Cellvizio, Maunakea Technologie, Paris, France 2), nach der Injektion eines makromolekularen fluoreszierenden Kontrastmittels Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (implantiert FITC-Dextran) mit einem...

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In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In diesem Beitrag stellen wir eine Methode, um Tumormikrogefäßen in vivo Analyse mit dynamischen Kontrastmittel-Fluoreszenz-Videomikroskopie. Zwei quantitative Parameter wurden erworben: funktionelle Kapillardichte was die Durchblutung des Tumors und Leckage Index spiegelt die Undichtigkeit der endothelialen Wand.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

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