Name: in vivo imaging of tumor angiogenesis using fluorescence confocal videomicroscopy
Uploaded: 2013-09-11T14:30:00
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1. Preparação do Agente de Contraste <ol><li> Para FITC-dextrano 70 kDa, a dose injectada é de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextrano diluído em 0,1 ml de solução salina por um rato pesando 20 g). </li><li> O agente não deve ser demasiado longo exposta à luz. Para evitar o branqueamento, é recomendado para cobrir o tubo com folha de alumínio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Os ratinhos foram anestesiados por uma injecção intraperitoneal de uma mistura de 1:4 de xilazina (Rompun 2%, ...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+concepts+of+the+angiogenic+process.">Fundamental concepts of the angiogenic process.</a> Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).</li><li>Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+confocal+fluorescence+microscopy+(Cell-viZio)+facilitates+extended+imaging+in+the+field+of+microcirculation.+A+comparison+with+intravital+microscopy.">Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy.</a> J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).</li><li>Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+angiogenesis.">Imaging angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).</li><li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contrast+enhanced+optical+imaging+of+capillary+leakage.">Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage.</a> Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).</li><li>Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+nitric+oxide+production.+Mechanisms+of+vascular+albumin+leakage.">Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage.</a> Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).</li><li>Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+capillary+leakage+is+involved+in+the+onset+of+anaphylactic+hypotension.">Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension.</a> Anesthesiology. , (2012).</li><li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).</li><li>Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+tumour+blood+vessels.">Disrupting tumour blood vessels.</a> Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).</li><li>Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+antitumor+treatment+by+means+of+fluorescence+molecular+tomography+with+an+annexin+V-Cy5.5+conjugate.">Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).</li><li>Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+optical+contrast+agent+dynamics+in+rat+tumors+by+use+of+diffuse+optical+spectroscopy+with+magnetic+resonance+imaging+coregistration.">In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration.</a> Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).</li></ol>

O estudo da microcirculação tumor tornou-se essencial para a compreensão da fisiopatologia do crescimento do tumor, disseminação e resposta à terapia 1. A imagem óptica é uma das técnicas que podem ser utilizadas para observar os vasos capilares, utilizando um agente de contraste fluorescente e para quantificar morfológica (Densidade capilar funcional) e de fuga (índice) parâmetros funcionais. A microscopia de fluorescência de imagem foram utilizados neste estudo tem ...

A angiogénese é um processo complexo que envolve uma formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. As alterações patológicas da microcirculação do tecido, composta de arteríolas, capilares, e vénulas, estão implicados numa vasta gama de doenças tais como o cancro, a inflamação, ou a diabetes. Portanto, é essencial para desenvolver métodos para avaliar quantitativamente a estrutura ea função microvascular. Imagem permite o estudo de microvasos em uma não-forma ou micro-invasivo, em tempo real e in vivo, e medidas repetidas ao longo do tempo no mesmo animal 2. Atualmente, a dinâmica com contraste (DCE) de imagem 3 é comumente utilizado para avaliar a microcirculação do tecido. Imagem com contraste dinâmico é uma técnica que segue ao longo do tempo a biodistribuição de um traçador injetado por via intravenosa. A partir desta aquisição, parâmetros quantitativos podem ser extraídos refletindo vascularização do tecido. DCE imagemfoi o mais frequentemente usado com CT, ressonância magnética ou ultra-som. No entanto, essas técnicas de imagem não permitir a visualização directa dos microvasos, uma vez que a sua resolução, a não ser com a utilização de dispositivos experimentais específicas, na maioria das vezes permanece macroscópica. Neste trabalho, propomos estudar a vasculatura do tumor na escala microscópica e in vivo utilizando imageamento óptico dinâmico com contraste, com fibered videomicroscopia confocal. Utilizou-se um agente de contraste macromolecular (FITC-dextrano) que permanece exclusivamente dentro de navios ou fugas através da barreira endotelial no interstício, de acordo com o seu peso molecular e as características do endotélio do tecido estudado 4. Isso permitiu que o estudo de ambos estrutura microvasos, delineando corretamente vasos e permeabilidade capilar, por vazamento e acumulando no interstício.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin serynge 
 Myjector 1ml 
 29G</td>
 <td>Terumo Europe </td>
 <td>BS-05M2913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>01619HH</td>
 <td>100 mg/mL 
 diluted in saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibered confocal videomicroscopy</td>
 <td>Cellvizio - MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>LSU-488</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probe ProFlexTM Z</td>
 <td>MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mosaicing software</td>
 <td>MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vessel detection software</td>
 <td>MaunaKea Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo imaging of tumor angiogenesis using fluorescence confocal videomicroscopy

Desfibrado de fluorescência confocal imagiologia in vivo com um feixe de fibras ópticas utiliza o mesmo princípio como microscopia confocal de fluorescência. Ele pode excitar fluorescente in situ elementos através das fibras ópticas, e depois gravar alguns dos fótons emitidos, através das mesmas fibras ópticas. A fonte de luz é um laser que emite luz de excitação através de um elemento no interior do feixe de fibras e como ele varre ao longo da amostra, uma recria a imagem de pixel por pixel. Como este tipo de exame é muito rápido, combinando-a com o software de processamento de imagem dedicada, imagens em tempo real com uma frequência de 12 quadros / s pode ser obtida. Nós desenvolvemos uma técnica para caracterizar quantitativamente morfologia e função capilar, usando um dispositivo de fluorescência confocal videomicroscopia. O primeiro passo em nosso experimento foi gravar 5 filmes seg nos quatro quadrantes do tumor para visualizar a rede capilar. Todos os filmes foram processados ​​usando o software (ImageCell, Mauna Kea Tecnologia, Paris, França) que realiza uma segmentação automatizado de vasos em torno de um diâmetro escolhido (10 mM em nosso caso). Assim, pode quantificar o &#39;densidade capilar funcional &quot;, que é a relação entre a área total do vaso, e a área total da imagem. Este parâmetro é um marcador substituto para a densidade microvascular, geralmente mensurados usando ferramentas de patologia. O segundo passo foi a gravar filmes do tumor ao longo de 20 min para quantificar a fuga do agente de contraste macromolecular através da parede capilar para o interstício. Ao medir a proporção de intensidade de sinal no interstício em relação à dos vasos, um &quot;índice de fuga &#39;foi obtida, agindo como um marcador substituto para a permeabilidade capilar.

Com os dados recolhidos, podemos analisar quantitativamente diferentes parâmetros que refletem a microcirculação. Foram estudados in vivo, a rede vascular periférica de um tumor do cólon implantadas em ratinhos Balb-C utilizando um sistema de fluorescência confocal videomicroscopia desfibrado (Cellvizio, Maunakea Tecnologia, Paris, França 2), após a injecção de um agente de contraste fluorescente macromolecular isotiocianato-dextrano ( FITC-dextrano) com um peso...

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In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.

Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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