Name: assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH гранты GM45916 и GM66834 к JCH и общения с Международной Ретта синдром Фонда AK Эта работа также была поддержана NIH грант GM088409 и Медицинского института Говарда Хьюза вклад в KL

1. Ассамблея рекомбинантных стержневых гистонов в октамеры Обоснование: Первый шаг в нуклеосомной восстановления массива является подготовка собственных основных гистонов октамеры из лиофилизированных рекомбинантных стержневых гистонов. Гистоновых белков объединен?...

<ol>
	<li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li><li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution:+determinants,+mechanisms,+and+functions.">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li><li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes,+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1.">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li><li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro:+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions.">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li><li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+(FoxA)+and+GATA-4.">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li><li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells:+correlation+of+accessibility,+methylation,+MeCP2+binding+and+acetylation.">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li><li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure.">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li><li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle.">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences.">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li><li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+*.">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution.">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li><li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization:+roles+of+amino+acid+sequence,+domain+length,+and+charge+density.">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li><li>Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications.">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li><li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure.">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li><li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure.">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li><li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution.">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li><li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway:+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin.">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li><li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays.">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems.">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li><li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays.">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li><li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure.">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li><li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

Модель массивы нуклеосомной являются очень полезным инструментом для изучения в пробирке структуры хроматина и функции. Например, они широко используются для изучения механизма образования конденсата хроматина волокна в растворе 30-34, и позволило получить структуру рентге...

Геномах эукариот не существуют как чистую ДНК, а уплотняются и организован связанных белков. Эти комплексы ДНК и белка известны как хроматина. Основная повторяющееся звено хроматина является нуклеосома. Нуклеосом состоит из гистона октамера и 146 пар оснований ДНК, обернутой вокруг гистона октамер примерно в 1,6 раза 1. Гистон октамер состоит из двух копий каждого из стержневых гистонов H2A, H2B, H3 и H4,. Основные гистонов октамеры, которые повторно расположенных вдоль молекулы ДНК называют нуклеосомной массивы. Расширенная структура нуклеосомных массивов был передан в качестве 10 нм волокна или &quot;бусины на нитке&quot; структуры и присутствует в пробирке в условиях низких соли 2. 10 нм волокна способен конденсации в высших порядков структур через внутри массива уплотнения и / или между массива олигомеризации 2. Эти структуры более высокого порядка может быть индуцирован в присутствии солей,или может быть под влиянием через связывание хроматина архитектурных белков в нуклеосомной массива 3,4. Уровни хроматина уплотнения являются обратно коррелирует со скоростью транскрипции в естественных условиях 5,6. Недавние исследования подчеркивает важность структурной организации геномов в таких процессах, как дифференциации, развитию рака и других 7,8. Использование нуклеосомных массивов изучать структуру хроматина и функции стала широко распространенной. Здесь мы опишем метод для сборки нуклеосомных массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и ДНК нуклеосом позиционирования. Использование рекомбинантной ДНК с тандемных повторов нуклеосомных последовательностей позиционирования позволяет восстановления массивов, которые содержат регулярно расположенных нуклеосом. Два из наиболее популярных последовательностей позиционирования являются последовательность гена 5S рРНК и &quot;601&quot; последовательность 9,10. Последовательность 601 была получена из SELEX экспериментов и море сильно позиционирует нуклеосом, чем последовательности 5S 11. Следовательно, длина линкера ДНК из 601 массивов является более однородным. Тандемно повтор ющиес нуклеосом ДНК позиционирование полученный с помощью гель-фильтрации 4,12. Рекомбинантные гистоны очищенный от E. палочка в условиях денатурирующих 13. Использование рекомбинантных гистонов позволяет тщательно контролировать гистонов состав нуклеосомных массивов. Например, стержневых гистонов принимая специфические мутации 14 или пост-трансляционные модификации 15,16 может быть заменен на дикого типа стержневых гистонов. Эксперименты скорости оседания контролировать скорость осаждения макромолекул в растворе при приложенном центробежной силы 17. Это дает информацию о размере и форме макромолекул в образце. Таким образом, эксперименты скорости оседания являются подходящим инструментом для изучения изменения состояния решения в хроматина волокнаСтруктура из-за конденсации хроматина 18. Важно отметить, что в первую очередь необходимо использовать эксперименты седиментации скорости как шаг контроля качества в нуклеосомной восстановления массива. Если ДНК и нуклеосомы не объединяются в надлежащее молярном соотношении, массивы могут быть недо-или перенасыщен стержневых гистонов. Таким образом, информация, полученная из экспериментов седиментации скорости используется для того, чтобы должным образом ДНК нуклеосомы насыщен. Важно использовать альтернативные методы оценки насыщенности ДНК с нуклеосом, особенно при работе с ранее неохарактеризованной ДНК-матрицы. Таким образом, мы также описывают способ анализа нуклеосомных массивах, используя атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ является мощная техника, которая позволяет визуализация эффектов ряда параметров, таких как уровень насыщенности, эффекта присутствия вариантов гистонов или последствий MgCl 2 19,20. АСМ также был Appliред изучать динамику нуклеосом используя промежуток времени визуализации 21. Экстракорпоральное собраны нуклеосомной массивы 12-мерные особенно поддаются АСМ исследований, потому что они принадлежат в правильном диапазоне размеров для АСМ-изображений 22. В настоящем исследовании мы использовали АСМ из нуклеосомных массивов как контроль качества, а также средства утверждения данные из AUC (&quot;увижу, не поверю»). В дополнение к простой визуализации, АСМ позволяет измерять профилей высоты образцов в качестве дополнительного показателя.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

Основные гистонов октамеры, которые повторно расположенных вдоль молекулы ДНК называют нуклеосомной массивы. Нуклеосомной массивы, полученные в одном из двух способов: очищение от естественных условиях источников в, или восстановление в пробирке из рекомбинантных стержневых гистонов и тандемно повторил ДНК нуклеосом позиционирования. Последний метод имеет то преимущество, что позволяет для сборки более композиционно форме и точно позиционируется нуклеосомной массива. Эксперименты скорости седиментации в аналитической информации текучести ультрацентрифуге о размере и форме макромолекул путем анализа скорости, с которой они мигрируют через раствора под действием центробежной силы. Этот метод, а также атомно-силовой микроскопии, могут быть использованы для контроля качества, гарантируя, что большинство ДНК-матриц насыщены нуклеосом после восстановления. Здесь мы опишем протоколы, необходимые для восстановления миллиграмм количества длину и композиционно Defined нуклеосомной массивы, пригодные для биохимических и биофизических исследований структуры хроматина и функции.

Для иллюстрации протокол мы восстанавливали нуклеосомной массивы из рекомбинантных Xenopus стержневых гистонов и ДНК, состоящих из 12 тандеме 207 б.п. повторы последовательности 601 позиционирования (601 207 х 12). Мы впервые собрался родные октамеры из лиофилизированных стержневых ги...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA at JoVE.com

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Представлен метод для восстановления модельных нуклеосомных массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и тандемно повторного ДНК нуклеосом позиционирования. Мы также описать, как эксперименты скорости оседания в аналитической ультрацентрифуге и атомно-силовой микроскопии (АСМ) используются для мониторинга масштабов нуклеосомной насыщения массива после восстановления.

Ассамблея нуклеосомной массивов из рекомбинантных стержневых гистонов и позиционированием нуклеосом ДНК

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Cells and their Components

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Объединение QD-FRET и Microfluidics для мониторинга ДНК Nanocomplex самосборки в режиме реального времени

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Добыча высокомолекулярных ДНК Геномная Вес от почвы и осадков

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Разработка и использование Мультиплексированный массивы хемостата

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...