Name: assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag GM45916 och GM66834 till JCH och ett stipendium från International Rett Syndrome Foundation till AK Detta arbete stöddes också av NIH bevilja GM088409 och Howard Hughes Medical Institute bidrag till KL

1. Montering av rekombinanta kärnhistonerna till oktamerer Bakgrund: Det första steget i nukleosomal array rekonstituering är att framställa nativa kärn histon oktamerer från lyofiliserade rekombinanta kärnhistonerna. Histonproteiner kombineras i lika stora molära mängder och monteras i histon oktamerer genom dialys proverna av ett denatureringsbuffert i återveckningsbuffert. <ol><li> Rena och lyofilisera rekombinanta kärnhistonerna (H2A, H2B, H3, H4) som beskrivs 13....

<ol>
	<li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li><li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution:+determinants,+mechanisms,+and+functions.">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li><li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes,+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1.">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li><li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro:+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions.">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li><li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+(FoxA)+and+GATA-4.">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li><li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells:+correlation+of+accessibility,+methylation,+MeCP2+binding+and+acetylation.">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li><li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure.">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li><li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle.">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences.">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li><li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+*.">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution.">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li><li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization:+roles+of+amino+acid+sequence,+domain+length,+and+charge+density.">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li><li>Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications.">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li><li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure.">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li><li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure.">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li><li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution.">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li><li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway:+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin.">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li><li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays.">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems.">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li><li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays.">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li><li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure.">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li><li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

Modell nukleosomala arrayer är ett mycket användbart verktyg för att studera kromatin struktur och funktion in vitro. Exempelvis har de använts i stor utsträckning för att studera mekanismen för kromatin fiber kondensation i lösning från 30 till 34, och gjort det möjligt att erhålla en röntgenbild strukturen hos en tetranucleosome 35. På senare tid har de visat sig vara användbara för att dechiffrera de strukturella effekterna av specifika kärn histon varianter, mutanter oc...

Eukaryota genom existerar inte som naket DNA, utan snarare kompakteras och organiseras av bundna proteiner. Dessa komplex av DNA och protein är kända som kromatin. Den grundläggande repeterande enhet av kromatin är nukleosomen. En nukleosomen består av histon oktamer och 146 baspar av DNA lindas kring histon oktamer ca 1,6 gånger 1. Den histon oktamer består av två exemplar vardera av kärn histoner H2A, H2B, H3 och H4. Kärn histon oktamerer som upprepade gånger är placerade längs en DNA-molekyl som kallas nukleosomala matriser. Den utökade struktur nukleosomala matriser har kallat 10 nm fiber eller &quot;pärlor på ett snöre&quot; struktur och finns in vitro under låga saltförhållanden 2. Den 10 nm fiber kan kondensera till högre ordningens strukturer genom intra-array packning och / eller inter array oligomerisering 2. Dessa högre ordningens strukturer kan induceras i närvaro av salter,eller kan påverkas genom bindning av kromatin arkitektoniska proteiner till nucleosomal array 3,4. Nivåer av kromatin kompakte är omvänt korrelerad med graden av transkription in vivo 5,6. Ny forskning belyser vikten av organisationsstruktur genomen i processer såsom differentiering, cancerutveckling, och övriga 7,8. Användningen av nukleosomala matriser för att studera kromatin struktur och funktion har blivit utbredd. Här beskriver vi en metod för montering av nukleosomala matriser från rekombinanta kärnhistonerna och nukleosomen positionering DNA. Användning av rekombinant DNA med tandemupprepningar av nukleosomen positioneringssekvenser möjliggör beredning av matriser som innehåller regelbundet åtskilda nucleosomes. Två av de mer populära positioneringssekvenser är 5S rRNA-gensekvens och &quot;601&quot;-sekvens 9,10. Den 601-sekvensen härleddes från SELEX experiment och more starkt positionerar nucleosomes än 5S sekvensen 11. Följaktligen är den linker-DNA längd av 601 arrayer mer homogen. Tandem upprepade nukleosomen positionering DNA erhålls genom gelfiltrering 4,12. Rekombinanta histoner renas från E. coli under denaturerande betingelser 13. Användningen av rekombinanta histoner tillåter en att noggrant styra histon sammansättning nukleosomala matriser. Till exempel, histoner kärna bär specifika mutationer 14 eller posttranslationella modifieringar 15,16 kan ersätta vildtyp kärnhistonerna. Sedimente hastighet experiment övervaka graden av sedimentering av makromolekyler i lösning under en tillämpad centrifugalkraft 17. Detta ger information om storleken och formen av makromolekyler i ett prov. Sedimente hastighet experiment är därför ett lämpligt verktyg för att studera lösning tillstånd ändras i kromatin fiberstruktur på grund av kromatinkondensation 18. Viktigt är det först nödvändigt att använda sedimentehastighetsexperiment som en kvalitetskontroll steg i nucleosomal array beredning. Om DNA och nucleosomes inte kombineras på rätt molförhållandet kan arrayer vara under-eller övermättad med kärn histoner. Således är den information de fått från sedimenteringshastighet experiment används för att säkerställa att DNA är ordentligt mättad med nukleosomer. Det är viktigt att använda alternativa metoder för att uppskatta mättnad av DNA med nukleosomer, speciellt om du arbetar med en tidigare uncharacterized DNA-mall. Därför beskriver vi också en metod för analys av nukleosomala arrayer med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM är en kraftfull teknik som tillåter visualisering av effekterna av ett antal parametrar, såsom graden av mättnad, effekten av närvaron av histon varianter eller effekterna av MgCl 2 19,20. AFM har också varit tillämped för att studera nukleosomen dynamik med intervall avbildning 21. In vitro monterade nukleosomala 12-mer-arrayer är särskilt mottagliga för AFM studier därför att de hör hemma i rätt storleksordning för AFM avbildning 22. I den aktuella studien har vi använt AFM av nukleosomala matriser som en kvalitetskontroll och som ett sätt att bekräfta data från AUC (&quot;se är att tro&quot;). Förutom enkel visualisering, gör AFM mätning av höjdprofiler av prov som ett extra mått.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

Kärn histon oktamerer som upprepade gånger är placerade längs en DNA-molekyl som kallas nukleosomala matriser. Nucleosomal matriser erhålles på ett av två sätt: rening från in vivo-källor, eller rekonstitution in vitro från rekombinanta kärnhistonerna och i tandem upprepade nukleosomen positionering DNA. Den sistnämnda metoden har fördelen att möjliggöra montering av en mer sammansättningsmässigt likformig och exakt positionerad nucleosomal array. Sedimentation velocity experiment i analytisk ultracentrifug utbyte information om storleken och formen av makromolekyler genom att analysera den takt med vilken de migrerar genom lösningen under centrifugalkraft. Denna teknik, tillsammans med atomkraftsmikroskopi, kan användas för kvalitetskontroll, vilket garanterar att de flesta DNA-mallar är mättade med nukleosomer efter beredning. Här beskriver vi de protokoll som är nödvändiga för att rekonstituera milligramkvantiteter längd och sammansättnings defined nukleosomala matriser lämpliga för biokemiska och biofysikaliska studier av kromatin struktur och funktion.

För att illustrera det protokoll vi beredda nukleosomala arrayer från rekombinanta Xenopus core histoner och DNA som består av 12 tandem 207 bp upprepningar av 601 positioneringssekvens (601 207 x 12). Vi monteras först nativa oktamerer från lyofiliserade kärnhistonerna och renades sedan de oktamerer genom FPLC med användning av en S200-kolonn (Figur 1A). Större komplexen eluerar tidigare från S200-kolonn. Histoner elueras allmänt i denna ordning: ospecifika histon aggregat...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA at JoVE.com

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

En metod presenteras för beredning av modell nukleosomala arrayer från rekombinanta kärnhistonerna och tandem upprepade nukleosomen positionering DNA. Vi beskriver också hur sedimenteringshastighet experiment i analytisk ultracentrifug och atomkraftsmikroskop (AFM) används för att övervaka omfattningen av nucleosomal array mättnad efter beredning.

Montering av nucleosomal arrayer från rekombinanta Kärn Histoner och nukleosom Positionering DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Cells and their Components

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissekering av Organizer och Animal explants Pole från Xenopus laevis Embryon och församlingen i en cell Adhesion analys

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolering av genomisk DNA från mus Tails

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Kombinera QD-bandet och Mikrofluidik till Monitor DNA Nanocomplex självorganisering i realtid

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Utformning och användning av Multiplexad kemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion och rening av rekombinant Murina Kindlin-3 från insektsceller för biofysikalisk Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Icke-kromatografisk rening av rekombinant Elastin liknande polypeptider och deras fusioner med peptider och proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...