Name: high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots at JoVE.com

この作業の一部は助成R 44 AI072784下国立衛生研究所（NIH）によってサポートされていました。我々は博士キルスティンセントジョージ、サラB. Griesemer、ダリルラムソンとウイルス病研究室のエイミー·ディーン、定量インフルエンザビリオンと臨床的に検証されインフルエンザへのアクセスをリアルタイム用ズワースセンター、ニューヨーク州保健部に感謝PCRアッセイ。

<ol>
	<li>Boom, R., Sol, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Baker, M. 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TruTipの概念およびワークフローの簡略化（ 図1）、それは容易に適合させる、自動化された効率的および臨床サンプルマトリックス、入力サンプルボリューム、および液体ハンドリングシステムの数のために有効である。これは、すべての臨床試料が一意であることが認識されるべきであり、粘度、粒子状物質、粘液、表面汚染物質、微生物、および/またはヒトの遺伝的背景の次に1つを変化するであろう。臨床試料組成物および自動TruTipサンプル調製プロトコルの利用目的の予想ばらつきを考えると、それは、したがって、特定のサンプルの種類の所望の結果を達成するために、TruTip手順における特定のステップを修正する必要があるかもしれない。かかわらず、サンプルタイプの、しかし、典型的に核酸の純度及び/又は回収に最も大きな影響を及ぼすTruTipパラメータがあります。 <ol><li> 溶解バッファー（とアルコール）との混合と均質化のサンプル。TruTips再を持っているがlatively大きな細孔の大きさ、サンプルの均質化と液化は、効率的な細胞溶解のために非常に重要である、とTruTipモノリス以降の結合手順。均質かつ十分に液化溶解物、サンプルがサンプル全体の処理時間を短縮し、より高い流量を有するTruTipを介して移動することができる。大容量プラズマプロトコルは、大きな入力サンプル量にもかかわらず、完全に均質と難しいサンプル（オンラインまたはオフライン）液化するためのユーザーのための可能性を示しています。 </li><li> 流速。遅い流速核酸結合又は溶出中には、通常、全体の処理時間を犠牲にもかかわらず、より高い核酸収量をもたらす。遅い流量はまた、DNAのせん断の程度を減らすことができます。 </li><li> サイクル数。吸引の最適な数とサイクルを分配するには、サンプルの種類、総サンプル量、および流速に依存する。 図1のステップ1は、典型的には、サイクルnumbeポイントですRS（と流量）などの異なる患者からNPA粘度の範囲のために最適化するために、より挑戦的な溶解物のいずれかを表す咽頭吸引（ 図5）のようなサンプルを用いて、いくつかの実証的な最適化が必要になる場合があります。 </li><li> 乾燥。TruTipモノリスの完全な乾燥が精製された核酸試料を抑制下流のプロセスまたはテストを共溶出するから残留有機溶剤を防止することが不可欠である。 TruTipを遠心分離又は吸引濾過によって乾燥されていないので、乾燥工程中に流量およびサイクル数の両方を最大化することが重要である。たまに乾燥サイクルが完了した後TruTipの末端に洗浄液の残液滴が存在する。ハミルトンロボットは、それによって無溶媒溶出を確実に、液滴を解放するために井戸の側の &quot;先端タッチ&quot;を実行する能力を持っています。 epMotionシステムがこの機能を持っているが、エルでTruTip末端のプレすすぎませんutionバッファは、同じ効果を達成するようにプログラムすることができる。 </li></ol>ロボットアームチャネルに幾何学、ピペットチップ材料、及び取り付け方法は、各機器メーカー一意であるため、異なるTruTip構築物は、それぞれの液体ハンドリングシステムのために必要とされる。 TruTipモノリス寸法（直径、厚さ、孔径）は、核酸結合能（および溶出効率）と相関しない、などの任意の固相抽出技術が期待される。厚い（&gt; 4 mm）の行列は、大容量のサンプルのための核酸結合容量を増加および/または特定のTruTip形式を横切る結合容量が等しくなるように、1mlのTruTipに埋め込まれてもよいが、TruTipの厚さとの間の流量との間にトレードオフが存在する初期結合工程（粗溶解の存在下で）。従って、それは（ 例えば&lt;、自動化されたプロトコルの最初のステップのための大ボリュームピペットチップに大径のモノリスを埋め込 ​​むことが時として有利で ​​ある/ em&gt;の大容量抽出のために5ミリリットルハミルトン/ Akonni TruTips）。リキッドハンドリングロボットの製造業者によって規定特定TruTip構成を考えると、しかし、我々は、必ずしもTruTip核酸利回りは異なるメーカーの、または異なるTruTipサイズ渡るリキッドハンドリングプラットフォーム間で同一であることを期待しないでください。 彼らは通常は無菌の部位（ 例えば脳脊髄液）から取得していない限り、臨床検体は（定義により）ヒトゲノムDNAのかなりの量が含まれます。他のアプリケーションで不要なヒトDNAゲノムの背景（ 図5のような）を表す一方、時にはヒトゲノムDNAは、（ 図6のように）が望まれている。バックグラウンドDNAの存在は、通常モノリスの結合容量を超えない試料中の核酸の総量限り、問題とならない、背景DNAは、キャリアとして機能することができ、所望の標的核酸場合酸は微量で存在する。ことを除いて感染症検査の試料調製対物レンズに類似している大容量の血漿抽出プロトコール（ 図7）母系DNAの10〜20倍過剰の存在下で（断片化）胎児DNAを単離すること、を目的配列は高度に合同であるとのみ特異性の高い分子検査および/またはサイズの差別によって区別す​​ることができます。この場合には、総循環DNAを5mlのTruTipを用いて単離し、高分子続くと低分子量の胎児DNAを、結合バッファー条件を変えることによって、1mlのTruTipに後続の結合および溶出を介して分離される。シリカモノリスへの結合および溶出特性に基づいて標的核酸の選択的なサイズ分離と濃縮は、膜またはサイズ排除スピンカラムによって達成さよりも有意に異なる作用機モードである。ヒトゲノムDNAからサイズ分離と微生物のDNAの濃縮は、かもしれないカスタマイズTruTip結合および溶出バッファーを経由して、将来のアプリケーションでccomplished。 自動化されたプロトコルは、多様な臨床サンプル、そしてそれがどのように大規模なボリュームと特定の液体ハンドリングロボットに適合させることができるを処理するためTruTipモノリス自体の有用性を強調してここに示しました。合理化された方法は、典型的には他の自動化システムと比較してより高速な抽出プロトコールをもたらす。 TruTip手続きを自動化するために必要な主要なハードウェアはピペットチャンネルアーム自体ではなく、磁気棒、真空システムであるため、TruTip技術のシンプルさは、しかし、また、新しい、自動化された核酸精製システムを購入に興味のある人のためのいくつかのコスト優位性を与える、または遠心分離機オンボード。予め充填された試薬プレートを利用することも領域と必要な消耗を低減し、走行あたりのスルー​​プットを倍増できる。 TruTipプロトコルでデッキスペースを最小限に抑えることも、上流またはdを統合する上級ユーザーを可能にするTruTipとownstream自動化されたプロセス。例えば分別全血にハミルトンのeasyBloodソリューションが大幅にバイオバンキングプロセスを合理化したい自動TruTip抽出方法で組み込むことができます。このような核酸定量、正規化、PCRをセットアップ、またはDNA配列としてポスト抽出プロセスも容易に大きくリキッドハンドリングプラットフォーム上TruTipに統合されています。

核酸精製は、のみを使用し、ほとんどの研究分子診断のために必要であり、ライフサイエンスアプリケーション。様々なアプローチが、その多くは、カオトロピック塩1の存在下でシリカに結合する核酸の基本的な原理に基づいており、フェノール/クロロホルム抽出の時から浮上している。抽出プロセスは、（2-13に例を参照）、スピンフィルタ、磁気ビーズおよびライフサイエンス業界を支配して関連するアプローチで、様々なビーズとメンブレンベースの形式を使用することにより合理化および自動化されています。効果的で挑戦的な臨床行列に直面したとき、粒子と膜は限界を知っていた。例えば、膜およびビーズベースの列が対応し、小孔サイズを（従って、高い背圧）があり、遠心分離または真空システムによって処理されるために、支持体のいくつかのタイプを必要とする。膜やビーズ列結果のの物理的特性効率的な消耗、及び/又は一方向流路を加工することができる合計（入力）サンプル量を詰まらせることなく処理することができる試料の種類を制限する重要な流体抵抗。逆に、磁性粒子は攪拌により試料全体に分散されている必要があります。均一溶液中に磁性粒子を分散させる必要が最も磁気ビーズ消耗品を使用して処理することができる総入力サンプル量を制限する。臨床サンプルの属性（例えば、粘度や複雑さなど）がチューブまたはロッドの側面に非効率的な磁気粒子濃度につながることができます。また、シリカ微粒子は、その磁化を失い、最終サンプルを汚染する、抽出プロセス中にビーズのオフに破ることができる。 TruTip技術は、これらの核酸試料処理の制約および制限14のいくつかを克服するために開発された。多孔質モノリス内に埋め込むことによりピペットチップは、流体の背圧が低下し、真空下（ すなわち、ピペット吸引）による流量制御を可能にする。この機能は、大幅に簡素化することが困難な試料タイプ（ 図1）から核酸を精製するために必要な抽出処理および計装を可能にする。モノリスのジオメトリと気孔率はモノリスの厚さは1.0から5.0ミリリットルまでのサンプル量に十分な核酸結合容量を提供しながら、目詰まりを最小限にするために調整されています。検体吸引分注時の双方向の流れがサンプル抽出かつ効率的な核酸の回収および溶出に対する結合モノリスとの間の延長された滞留時間を可能にし、ピペットチップ自体の体積容量を超えること処理される比較的大きな試料体積を可能にする。我々は以前に、シングルまたはマルチチャネルライを使用して、鼻咽頭サンプルからインフルエンザRNAを精製するための手動TruTip手順の開発と応用が報告され忍ピペッター15。同等の抽出効率が10 6遺伝子コピーで自動QIAcubeと手動TruTipメソッド間インフルエンザ当たりミリリットル鼻咽頭吸引液を得た。本研究の目的は、一般的に基準臨床検査で見つかった液体ハンドリングロボットを用いた鼻咽頭吸引（NPA）および他の臨床的に関連するサンプルタイプの中·高スループット自動化TruTip核酸の精製手順を実証することであった。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。モノリスの形状は、1.0から5.0ミリリットルにボリュームの範囲の特定のピペットチップに適合させることができる。モノリスの大気孔率は容易に最小限の流体の背圧でそれを通過する粘性または複雑なサンプルを有効にします。双方向フローは、モノリスと試料との間の滞留時間を最大化し、単一TruTip内で処理すべき大量の試料を可能にする。かかわらず、サンプルボリュームまたはTruTipジオメトリの基本的な手順は、細胞溶解、TruTipモノリスの内側の孔に結合核酸、結合していない試料成分と溶解緩衝液を洗い流し、適切な緩衝液中に精製し、濃縮した核酸を溶出するが含まれています。 TruTipの属性と適応はエッペンドルフepMotion 5070を使用して、3つの自動化された臨床サンプル処理プロトコルで実証されている鼻咽頭吸引液からRNAの単離、全血からのゲノムDNAの分離、及び母体血漿（それぞれ）の大ボリュームから胎児のDNA抽出と濃縮を含め、ハミルトンSTARとSTARplus液体ハンドリングロボット、。

NPAからインフルエンザRNA抽出のためのリアルタイムPCRデータは、 図5Aに示されている。推定された核酸抽出効率は、プロトコル15の手動バージョンで得られた結果と同様である。平均C T値の線形応答は、平均C Tの標準偏差が1未満の値を持つ6 4 10〜10遺伝子コピーミリリットル-1は 、（AとBインフルエンザ= 0.99と0.98、それぞれR 2）インフルエンザを改正した観察されサイクル。 epMotionシステムとの交差汚染の有無を10 6遺伝子コピーミリリットル-1 NPAを含む12正NPAサンプルは12バッファブランクが散在された図5Bに示されている。陽性対照の平均C tが ±0.14 30.16だった、とすべてのバッファー·ブランクが陰性であった。全試料の処理時間は、それぞれ8,16及び24の試料について16、28及び40分である。典型的な臨床鼻咽頭吸引または綿棒が10 7遺伝子コピーミリリットル-1（1,000 TCID 50あたりビリオン16と&gt; 10 4 TCID 50ミリリットル-1インフルエンザ17と仮定して）が含まれますので、自動epMotionプロトコルは過半数に有効であると期待されている臨床NPA標本の。 ヒトゲノムDNAに対して行わ分子試験の範囲を考えると、全血から核酸抽出の主な目的は、汚染物質を含まない、高分子量のゲノムDNAを製造することである。 96サンプルのための自動化されたプロトコル（ 例えばプロメガMagneSil = 90分とキアゲンQIAamp調製DNA血液バイオロボットMDxのシステム= 2.5時間）。 図6Aは、UV /可視吸光度プロファイルを示し、他の自動化されたシステムに比べて改善されて1時間内に完了する平均で、ハミルトンSTARプロトコル上の45試薬ブランクで同時に処理45陽性の血液サンプル<sub&gt; 280分の260 1.96の比率と1.93の平均230分の260比。 吸光度比260/280 1.7から2.0と230分の260比と&gt; 1.7は、一般的に残留塩、タンパク質や溶剤、最下流分子のアプリケーションのための許容の自由、非常に純粋なDNAを示すものである。 図6B中の1％アガロースゲルで得られたgDNAは、最小限の剪断を有する高分子量（&gt; 24キロバイト）であることを示している。 45陽性サンプルのフルセットからの平均核酸収率は5.26である±ライフテクノロジーズQuantifilerヒトDNA定量キットに基づいて、200μlの全血あたり0.46μgのヒトDNA、。 図5Bに示したものと同様交差汚染試験は陰性対照バッファブランク陽性サンプルが点在し、並行して抽出を行った。すべてのブランクが再びPCR（図示せず）による陰性であった。精製されたgDNAはまた、多数の他のPCRベースの解析（図示せず）に適している。 大容量TruTip手順で処理プールされた母体の血漿サンプルの8複製サンプルからリアルタイム結果を図7に示す。完全なプロトコル（オフラインプロテイナーゼKのインキュベーションを含む）は、核酸キット（全く同等の自動抽出キットはまだ利用できません）循環キアゲンマニュアルに似て約2.5時間、に仕上がっています。すべての複製の平均C T値は34.58±0.66及び29.76±胎児の男性（CHY）と合計（CH1）DNAのための0.50、それぞれ、自動化された抽出方法の優れた再現性を示しています。全DNAプール内の胎児DNAの濃度は（ゲノム換算）であり、2.8％の全サンプルにわたる結果平均％胎児DNAと、規格に適合ポイント分析の比較に基づいて計算されます。このサンプル抽出を実行する前にプールしたため、このサンプルの実際の％ウシ胎児DNAは不明である。胎児のDNA合成、非プール血漿サンプルはTruTip法を用いて抽出キアゲン循環核酸キット（図示せず）を用いた結果と比較して、典型的には1.5倍高い。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> 図1。 TruTip抽出処理と、液体ハンドリングシステムの作業の流れにかかわらず、その他の試料調製又は液体処理工程は、特定の液体処理装置およびソフトウェアの機能に応じて自動化されたルーチンに組み込むことができる。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> 図2。 （A）エッペンドルフepMotion 5070サンプルプレートレイアウト。試薬/ consuma（B）のアレンジメントワークテーブル上BLES。epMotionしか同時に8サンプルの最大値を処理しますが、サンプルプレートは、24サンプル（それぞれの列1、5および9）にするように構成できは<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> 図3。全血からゲノムDNAを精製するためのハミルトンSTARデッキレイアウト（ノンスケール）デッキポジション1 =ハミルトン1ミリリットルフィルタリングヒント; 2 =ハミルトン1ミリリットル非フィルタ処理のヒント; 3 = Akonni /ハミルトン1ミリリットルLPT 2ミリメートルのTruTips; 4 =入力血液サンプルキャリア（採血管やマイクロチューブ）、溶解緩衝液Fの5-9 = 290ミリリットル試薬トラフ、エタノールは、バッファJ、洗浄バッファーKと溶出バッファーA2を洗って、それぞれ、10 = 96 DEEPうまく結合板、11 = 96深井戸Jを洗って、12 = 96深井戸Kを洗う、13 = 96深井戸溶出板;ヌンク96ディープウェル培養プレートを14 =ハミルトンHHS2ヒーター/シェーカー; 15 = 50ミリリットル試薬トラフプロテイナーゼKを含む<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">より大きな数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> 図4。大容量の血漿試料（正確な縮尺ではない）からDNAを精製するためのハミルトンSTARplusデッキレイアウトシステムは、8×5ミリリットルのチャンネルと8×1ミリリットルのチャネル（デッキレイアウトに図示せず）を備えている。デッキポジション1 =ハミルトン4ミリリットルフィルタリングヒント; 2 = Akonni /ハミルトンを5ml TruTips; 3 =ソース血漿サンプル、4 = 50 mlコニカルチューブ、CN-W1、CN-W2とCN-W4を含む5 = 120ミリリットル試薬トラフreageNTS; CN-L1試薬を含む7 = 290ミリリットル試薬トラフ;; 8 = 290ミリリットル試薬トラフ含むCNプロテイナーゼK、CN-B2、CN-B3、EBA2、EBBとCN-W3試薬を含む6 =低容量試薬トラフ-B1試薬; 9ステップ1 = 96ディープウェルプレート、10ステップ2 = 96ディープウェルプレート、精製、最終製品のために11 =サンプルのキャリア、12 =ハミルトン1ミリリットルフィルタリングされていないヒント; 13 = Akonni /ハミルトン1ミリリットルLPT 4ミリメートルTruTipsは<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> 図5。 （）。インフルエンザウイルスの自動TruTip抽出からのリアルタイムPCRの結果は、鼻咽頭吸引（NPA）に添加。入力NPA体積=100μlを、溶出体積=50μlの。結果が3の複製、電子の平均である希釈レベルとインフルエンザターゲットごとに異なる​​5つのNPAの背景（N = 15）からxtractions。定量PCRは、以前15に記載のアッセイ条件にライトサイクラー480システム上で行われた。12正NPAサンプルテンプレートなしのコントロールおよび自動抽出手順の対象と散在しているとき（B）いいえ交差汚染が検出されない。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> 図6。ランダムに選択された10〜光度1000（ThermoFisher）から全血からのヒトゲノムDNA抽出の結果。）UV-可視トレースが複製されます。B）1％TruTip精製したgDNAのアガロースゲル。 M =フィッシャー24キロバイトマックスDNAラダー。レーン1から4 =〜100ngの精製gDNAを4からランダムに選択された複製。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> 図7。自由に血漿からDNAを循環させる8つの反復TruTip抽出からのリアルタイムPCRの結果。アスタリスク（*または**）で表されるサンプルは、別の日に抽出した。 CHYは男性胎児DNAを定量化し、CH1合計存在するDNA（胎児と母体の）を定量化します。定量PCRはCHYとCH1 18を標的と以前に発表されたアッセイとライトサイクラー480システム（Roche社）を行った。

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High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。これにより、試料調製フォーマットは、ほとんどの液体ハンドリング機器と互換性があり、高スループットの臨床応用およびサンプルタイプに多くの媒体を用いることができる。

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

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