Name: high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots at JoVE.com

Partes deste trabalho foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão R 44 AI072784. Agradecemos ao Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean, do Laboratório de Doenças Virais, Wadsworth Center, New York State Departamento de Saúde para virions gripe quantificados e acesso à clinicamente validado influenza em tempo real Os testes de PCR.

<ol>
	<li>Boom, R., Sol, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Baker, M. 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Os autores são funcionários da Akonni Biosystems, Inc., que produzem materiais utilizados neste artigo. Acesso gratuito e Produção deste artigo é patrocinado pela Akonni Biosystems, Inc.

A simplicidade do conceito TruTip e fluxo de trabalho (Figura 1) torna prontamente adaptados, automatizado, eficiente e eficaz para um número de matrizes de amostras clínicas, os volumes de amostras de entrada, e os sistemas de manuseamento de líquidos. Deve ser reconhecido, contudo, que cada amostra clínica é único, e variará de um para o outro na viscosidade, partículas, muco, os contaminantes da superfície, microbianos e / ou fundos genéticos humanos. Dadas as variações esperadas na composição da amostra clínica e utilizações previstas para um protocolo de preparação da amostra TruTip automatizado, pode ser necessário modificar alguns passos em um procedimento TruTip, a fim de alcançar os resultados desejados para um tipo de amostra específica. Independentemente do tipo de amostra, no entanto, os parâmetros TruTip que normalmente têm o efeito mais significativo sobre a pureza de ácido nucleico e / ou recuperação incluem: <ol><li> Exemplo de mistura e homogeneização com um tampão de lise (e álcool). Enquanto TruTips ter um revamente grande tamanho dos poros, a homogeneização da amostra e de liquefacção é muito importante para a lise eficiente de células, e os subsequentes passos de ligação ao TruTip monólito. Com um ligado homogénea e bem liquefeito, as amostras podem mover-se através do TruTip com taxas de fluxo mais elevadas, o que reduz o tempo global de processamento da amostra. O grande volume de plasma protocolo demonstra o potencial de usuários para homogeneizar cuidadosamente e liquefazer amostras difíceis (on-line ou off-line), apesar do grande volume de amostra de entrada. </li><li> As taxas de fluxo. Caudais inferiores durante ligação de ácido nucleico ou de eluição normalmente resultam em rendimentos mais elevados de ácido nucleico, embora à custa do tempo total de processamento. Taxas de fluxo mais lentas também pode reduzir a extensão de corte de DNA. </li><li> O número de ciclos. Número óptimo de aspiração e dispensar ciclos depende do tipo de amostra, o volume total da amostra, e as taxas de fluxo. Passo 1 da Figura 1 é tipicamente o ponto no qual numbe cicloRS (e as taxas de fluxo) pode exigir alguma optimização empírica, com amostras, tais como aspirado nasofaríngeo (Figura 5), que representa um dos lisados ​​mais desafiantes para optimizar devido à gama de viscosidades NPA de diferentes pacientes. </li><li> Secagem. Completa secagem da TruTip monólito é imperativo evitar que a partir de solventes orgânicos residuais co-eluindo com a amostra de ácido nucleico purificado e os processos a jusante, ou ensaios de inibição. Porque TruTip não é seca por meio de centrifugação ou filtração sob vácuo, é importante para maximizar tanto a taxa de fluxo e os números dos ciclos durante a etapa de secagem. Às vezes não é uma gotícula de solução de lavagem residual no terminal de TruTip após os ciclos de secagem está completada. Hamilton O robot tem capacidade para desempenhar um &quot;toque ponta&quot; do lado do poço, para libertar a gota, assegurando assim uma eluição livre de solvente. O sistema epMotion não tem esse recurso, mas uma pré-lavagem do terminal TruTip em ellução tampão pode ser programada para obter o mesmo efeito. </li></ol> Devido à geometria, material da ponta de pipeta, e método de fixação dos braços robóticos de canal são únicos para cada fabricante do instrumento, um constructo TruTip diferente é necessária para cada sistema de manuseamento de líquidos. As dimensões do monólito TruTip (diâmetro, espessura e tamanho de poro) que se correlacionam com a capacidade de ligação de ácido nucleico (e eficiências de eluição), como é esperado para qualquer técnica de extracção em fase sólida. Enquanto grossas (&gt; 4 mm) de matrizes pode ser incorporado em um 1 mL TruTip para aumentar a capacidade de ligação de ácido nucleico para as amostras de grandes volumes e / ou igualar a capacidade de ligação entre os formatos TruTip específicas, existe uma compensação entre a espessura TruTip e taxas de fluxo durante o passo inicial de ligação (na presença de lisados ​​brutos). Assim, é por vezes vantajoso incorporar monólitos de maior diâmetro em pontas de pipetas de maior volume para os passos iniciais de um protocolo automático (por exemplo, &lt;/ Em&gt; os 5 ml de Hamilton / Akonni TruTips para extrações de grande volume). Dadas as configurações TruTip específicas ditadas pelos fabricantes de robôs de manipulação de líquidos, no entanto, não necessariamente esperar rendimentos ácidos nucleicos TruTip ser idêntica em todas as plataformas de manuseio de líquidos de diferentes fabricantes, ou em diferentes tamanhos TruTip. As amostras clínicas (por definição) irá conter quantidades significativas de DNA genómico humano, a menos que eles são adquiridos a partir de locais normalmente estéreis (por exemplo, fluido espinhal cerebral). Por vezes, o DNA genómico humano é desejada (tal como na Figura 6), enquanto que em outras aplicações, o DNA humano representa um fundo genómico indesejado (tal como para a Figura 5). A presença de ADN de fundo não é normalmente problemática contanto que a quantidade total de ácido nucleico na amostra não exceda a capacidade de ligação do monólito, e o ADN do fundo pode servir como um transportador, se o alvo desejado nucleicoácido está presente em quantidades vestigiais. O objectivo do protocolo de extracção de plasma de grande volume (Figura 7) é isolar (fragmentada) de ADN fetal na presença de um excesso de 10-20 vezes de ADN materno, o qual é semelhante ao objectivo a preparação da amostra de teste de doenças infecciosas, excepto que As sequências são altamente congruente e só pode ser distinguido por testes moleculares altamente específica e / ou o tamanho da discriminação. Neste caso, o ADN total em circulação é isolado utilizando 5 ml de uma TruTip, e o ADN fetal de alto peso molecular e de baixo peso molecular são separadas por meio de posterior subsequente ligação e eluição com um 1 ml TruTip alterando as condições do tampão de ligação. Separação por tamanhos e de enriquecimento selectivo de ácidos nucleicos alvo com base na sua ligação e as propriedades de eluição a um monolito de sílica é um modo significativamente diferente da acção que a alcançada por membranas ou colunas de exclusão de tamanho de spin. Tamanho de separação e enriquecimento do DNA microbiano a partir de ADN genómico humano pode ser umccomplished em futuras aplicações via personalizando ligação TruTip e buffers de eluição. Os protocolos automatizados demonstrado aqui sublinhar a utilidade do próprio TruTip monólito para o processamento de diversas amostras clínicas, e como ele pode ser adaptado para grandes volumes específicos e robôs de manipulação de líquidos. Os métodos simplificados tipicamente resultar em protocolos de extracção mais rápido em comparação com outros sistemas automatizados. A simplicidade da tecnologia TruTip, no entanto, também oferece algumas vantagens de custo para os interessados ​​na compra de um novo sistema de purificação, automatizado ácido nucleico, porque o hardware primário necessário para automatizar procedimentos TruTip é o próprio braço canal pipeta ao invés de barras magnéticas, sistemas de vácuo ou on-board centrífugas. Utilizando placas de reagentes pré-cheias também podem reduzir o espaço e consumíveis necessários, eo dobro do rendimento per prazo. Minimizando o espaço deck com protocolos TruTip também permite que os usuários avançados para integrar a montante ou dprocessos automatizados ownstream com o TruTip. Por exemplo solução easyBlood de Hamilton para fraccionar sangue total podem ser incorporados com o método de extracção TruTip automatizado, o que iria simplificar significativamente os processos de bio-bancárias. Processos pós-extração, como a quantificação de ácidos nucleicos, a normalização, a PCR set-up, ou sequenciamento de DNA também são facilmente integrados com TruTip nas maiores plataformas de manipulação de líquidos.

Purificação de ácido nucleico, é necessário para os diagnósticos moleculares mais, a pesquisa usar apenas, e aplicações de ciências da vida. Várias abordagens têm emergido desde o tempo de extracções com fenol / clorofórmio, muitos dos quais se baseiam no princípio fundamental da ligação à sílica, na presença de sais caotrópicos um ácido nucleico. O processo de extração foi simplificada e automatizada através do uso de vários formatos e talão de membrana baseados, com filtros de rotação, esferas magnéticas e abordagens afins dominam setor de ciências da vida (ver exemplos em 2-13). Apesar de eficaz, as partículas e as membranas têm limitações conhecidas quando confrontado com matrizes clínicos desafiadores. Por exemplo, as membranas e colunas baseadas em grânulo são compatíveis, têm pequenas dimensões de poros (assim, pressões elevadas de volta), e requerem algum tipo de apoio, a fim de ser processada por um sistema de centrifugação ou de vácuo. As características físicas das membranas e resultam em colunas grânulofluídica resistência significativa, o que limita o tipo de amostras que podem ser processadas de forma eficiente sem obstruir o consumo, e / ou o volume total de amostras (de entrada), que pode ser uni-direccionalmente processados ​​através do percurso de escoamento. Inversamente, as partículas magnéticas deve ser distribuído em toda a amostra por agitação. A necessidade de distribuir homogeneamente as partículas magnéticas dentro de uma solução limita o volume de amostra total de entrada que pode ser processado com consumíveis grânulo mais magnéticas. Atributos amostra clínica (tal como a viscosidade ou a complexidade) pode levar a uma concentração de partículas magnéticas ineficiente do lado de um tubo ou haste. Além disso, as partículas finas de sílica podem desprender das esferas durante o processo de extracção, a perder a sua magnetização e contaminar a amostra final. A tecnologia TruTip foi desenvolvido para superar algumas dessas limitações de ácidos nucleicos de amostras de processamento e limitações 14. Ao incorporar um monólito poroso dentro de umponteira, fluídico contrapressão é reduzida, o que permite o controle de fluxo de vácuo (ou seja, pipeta de aspiração). Esta característica permite que o processo de extracção e de instrumentação necessária para purificar ácidos nucleicos a partir de tipos de amostra difíceis de ser muito simplificada (Figura 1). A geometria e porosidade do monólito é adaptada para minimizar o entupimento, enquanto que a espessura do monólito proporciona uma capacidade de ligação de ácido nucleico suficiente para volumes de amostra de 1,0 a 5,0 ml. Fluxo bidireccional da amostra, durante a aspiração e distribuição permite tempos de residência prolongados entre o extracto da amostra e o monólito de ligação para recuperação de ácido nucleico e a eluição eficiente e permite que volumes de amostra relativamente grandes a serem processados ​​que exceda a capacidade do volume da ponta da pipeta em si. Nós relatamos anteriormente, o desenvolvimento e aplicação de um procedimento TruTip manual para purificar RNA de gripe a partir de amostras de nasofaringe usando uma única ou multi-canal Rainin pipeta 15. Eficiências de extracção equivalentes, foram obtidas entre automatizado QIAcube e métodos TruTip manuais em 10 6 cópias do gene da gripe A por ml aspirado nasofaríngeo. O objetivo deste estudo foi demonstrar os procedimentos de média e alta taxa de transferência, automatizados TruTip purificação de ácidos nucleicos para aspirado nasofaríngeo (NPA) e outros tipos de amostras clínicas relevantes, utilizando robôs para manipulação de líquidos comumente encontrados em laboratórios clínicos de referência.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. A geometria do monólito pode ser adaptado para ponteiras específicas que variam de volume de 1,0 a 5,0 ml. A grande porosidade do monólito permite amostras viscosas ou complexas para passar facilmente através dele com contrapressão fluídica mínima. Fluxo bidireccional maximiza o tempo de residência entre o monolito e amostra, e permite grandes volumes de amostra a ser processado dentro de uma única TruTip. Os passos fundamentais, independentemente do volume de amostra, ou de geometria TruTip incluem a lise celular, a ligação para os poros interiores do TruTip monólito de ácido nucleico, embora a lavagem de componentes de amostra não ligados e tampões de lise, e eluindo os ácidos nucleicos purificados e concentrados em um tampão adequado. Os atributos e adaptabilidade de TruTip são demonstrados em três protocolos de processamento de amostras clínicas automatizados usando um epMotion Eppendorf 5070, Hamilton STAR e Starplus robôs de manipulação de líquidos, incluindo o isolamento de RNA a partir de aspirado nasofaríngeo, o isolamento de DNA genómico a partir de sangue total, e de extracção do ADN fetal e de enriquecimento a partir de grandes volumes de plasma materno (respectivamente).

Dados de PCR em tempo real para influenza extração de RNA a partir de NPA são mostrados na Figura 5A. A eficiência da extracção do ácido nucleico estimado é semelhante aos resultados obtidos com a versão manual do protocolo 15. Uma resposta linear em média de valores de C T pode ser observada entre 10 4 e 10 6 ml -1 cópias do gene alterado gripe (R 2 = 0,99 e 0,98 para influenza A e B, respectivamente), com desvios padrão da média C t valores inferiores a 1 ciclo. A ausência de contaminação cruzada com o sistema epMotion é demonstrado na Figura 5B, em que 12 amostras positivas NPA contendo 10 6 ml -1 cópias do gene ANF foram intercalados com espaços tampão 12. A média de C t para os controles positivos foi de 30,16 ± 0,14, e todos os espaços em branco tampão foram negativos. O tempo total de processamento da amostra é de 16, 28 e 40 min para 8, 16 e 24 amostras, respectivamente.Porque um aspirado nasofaríngeo clínico típico ou chumaço conterá 10 cópias do gene 7 ml -1 (assumindo 1000 viriões por TCID 50 e 16&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 gripe 17), o protocolo epMotion automatizada está prevista para ser eficaz na maioria de espécimes clínicos NPA. Dada a variedade de testes moleculares realizados em ADN genómico humano, o objectivo primário de extracção de ácido nucleico a partir de sangue total é o de produzir, o ADN genómico sem contaminantes de alto peso molecular. O protocolo automático para 96 amostras é concluída dentro de 1 hora, o que é uma melhoria em relação a outros sistemas automáticos (por exemplo, a Promega MagneSil = 90 min e Qiagen QIAamp DNA Sangue BioRobot sistema MDx = 2,5 horas). Figura 6A mostra os perfis de absorvância no UV / VIS 45 amostras de sangue positivas transformadas simultaneamente com 45 brancos de reagentes sobre o protocolo de Hamilton em estrela, com uma média A <sub&gt; Rácio de 1,96 260/280 e uma proporção média de 1,93 260/230. Um A 260/280 proporção entre 1,7-2,0 e uma proporção 260/230&gt; 1,7 são geralmente indicativos de ADN muito pura, isento de sais residuais, proteínas ou solventes, e aceitável para aplicações moleculares mais a jusante. O gel de agarose a 1% na Figura 6B mostra que a gDNA resultante é de elevado peso molecular (&gt; 24 kb), com corte mínima. O rendimento médio de ácido nucleico a partir de todo o conjunto de 45 amostras positivas é de 5,26 ± 0,46 ug de ADN humano por 200 uL de sangue total, com base na Life Technologies Quantifiler Quantificação do ADN humano Kit. Estudos de contaminação cruzada semelhantes àqueles mostrados na Figura 5B foram realizadas com placas de controlo negativo de tampão intercaladas com as amostras positivas e extraída em paralelo, todos os espaços em branco foram novamente negativos por PCR (não mostrado). A purificada gDNA também é adequado para numerosas outras análises baseadas em PCR (não mostrado). Resultados em tempo real a partir de oito amostras idênticas de uma amostra de plasma materno reunidas processado com o procedimento TruTip grande volume são mostrados na Figura 7. O protocolo completo (incluindo o off-line de proteinase K de incubação) é terminada em cerca de 2,5 h, semelhante ao manual Qiagen Circulação Nucleic Acids Kit (kit de extracção automatizadas não são ainda comparáveis ​​disponíveis). Os valores médios de C T mais de todas as repetições são 34,58 ± 0,66 e 29,76 ± 0,50 para o feto macho (CHY) e o ADN total (CH1), respectivamente, o que demonstra excelente repetibilidade do método de extracção automática. A concentração de ADN fetal no pool de DNA total (em equivalentes do genoma), é calculado com base na comparação de análise de ponto de ajuste de padrões, com a média de ADN fetal resultando% em todas as amostras de 2,8%. A DNA real fetal% para esta amostra é desconhecido, porque as amostras foram recolhidas antes de realizar a extracção. Composição do DNA fetalAs amostras de plasma em não-combinadas extraído utilizando o método TruTip são tipicamente cerca de 1,5 vezes mais elevado comparado com os resultados com um Qiagen Circulação Nucleic Acids Kit (não mostrado). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figura 1. O processo de extracção TruTip e fluxo de trabalho, independentemente do sistema de manuseamento de líquidos. Outros passos de preparação de amostra ou de processamento de líquidos pode ser incorporada rotinas automatizadas, dependendo das capacidades do aparelho de manipulação de líquidos específicos e de software. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 layout da placa de amostra. (B) Arranjo de reagentes / Consumaveis na mesa de trabalho. amostra A placa pode ser configurado para até 24 amostras (colunas 1, 5 e 9, respectivamente), embora a epMotion só irá processar um máximo de 8 amostras simultaneamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figura 3. Hamilton layout de convés ESTRELA para a purificação de DNA genômico de sangue total (sem escala) Baralho posição 1 = Hamilton 1 ml dicas filtradas; Hamilton. 2 = 1 ml dicas não-filtradas, 3 = Akonni / Hamilton de 1 ml LPT dois milímetros TruTips, 4 = entrada de portadores de amostras de sangue (tubos de coleta de sangue ou tubos de microcentrífuga), 5-9 = 290 ml depressões reagentes para Lise F, etanol, solução tampão J, K e Wash Buffer eluição tampão A2, respectivamente, 10 = 96 deep prato bem Binding; 11 = 96 poço profundo Lave J; 12 = 96 poço profundo Lave K; 13 = 96 prato eluição poço profundo; 14 = Hamilton HHS2 aquecedor / agitador com Nunc 96 placa de incubação poço profundo; 15 = 50 ml através de reagente contendo proteinase K. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Figura 4. Hamilton disposição Starplus convés para a purificação de ADN a partir de amostras de plasma de grande volume (não à escala). O sistema está equipado com canais de 8 x 5 ml e 8 x 1 ml, os canais (não mostrado no esquema da prancha). Baralho Posição 1 = Hamilton 4 ml dicas filtradas, 2 = Akonni / Hamilton de 5 ml TruTips, 3 = amostras de plasma de origem, 4 = 50 ml tubos cônicos, 5 = 120 ml depressões reagente contendo CN-W1, W2 e CN-CN-W4 REAGEnts, ​​6 = calhas reagentes de baixo volume contendo proteinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB e CN-W3 reagentes, 7 = 290 ml através reagente contendo reagente CN-L1; 8 = 290 ml através reagente contendo CN -B1 reagente; 9 = placas de 96 poços profundos para a etapa 1, 10 = 96 placas de poço profundo para a etapa 2, 11 = portadores de amostra para purificada, produto final; 12 = Hamilton 1 ml dicas não filtradas, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figura 5. (A). Real-time PCR resultados da extração TruTip automatizada de vírus influenza adicionado em aspirado nasofaríngeo (NPA). APN = volume de 100 ul de entrada, o volume de eluição = 50 ul. Os resultados são a média de três e replicamxtractions a partir de 5 NPA fundos distintos (n = 15) por o nível de diluição e de destino da gripe. qPCR foi realizada no sistema LightCycler 480 com condições de ensaio descritas anteriormente 15. (B) Sem contaminação cruzada é detectado quando 12 amostras positivas NPA são intercaladas sem controles de modelo e submetidos a processo de extração automática. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Figura 6. Resultado da extracção de ADN genómico humana a partir de sangue inteiro a.) Vestígios de UV-visível a partir de 1000 NanoDrop (ThermoFisher) seleccionados aleatoriamente a partir de 10 repetições. B) 1% de gel de agarose de gDNA TruTip purificada. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng purificada gDNA de quatro aleatoriamente selecionado repetições. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figura 7. Em tempo real os resultados da PCR de oito replicar extrações TruTip de livremente circular de DNA de amostras de plasma. Denotados por asteriscos (* ou **) foram extraídos em dias separados. CHY quantifica DNA fetal masculino e CH1 quantifica total de DNA presente (fetal e maternal). qPCR foi realizada num sistema de 480 LightCycler (Roche), com o objectivo de ensaios publicados anteriormente CHY e CH1 18.

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High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. Por conseguinte, a preparação da amostra é de formato compatível com os instrumentos de manipulação mais líquidos, e pode ser usado para muitos médio para aplicações clínicas de alto rendimento e tipos de amostras.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

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