Name: high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots at JoVE.com

Части этой работы были при поддержке Национального института здоровья (NIH) в рамках гранта R 44 AI072784. Мы благодарим доктора Кирстен Святого Георгия, Сара Б. Griesemer, Дэрил Lamson и Эми Дин лабораторией вирусных заболеваний, Уодсворта центр штата Нью-Йорк Министерство здравоохранения для количественно вирионы гриппа и доступ к клинически подтверждены гриппа в реальном времени ПЦР-анализ.

<ol>
	<li>Boom, R., Sol, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Baker, M. P., Mitchell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+genomic+DNA+from+blood+using+a+novel+filter-based+DNA+purification+technology.">Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology.</a> BioTechniques. 31, 142-145 (2001).</li><li>Sinclair, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+bead+or+not+to+bead:+applications+of+magnetic+bead+technology.">To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology.</a> The Scientist. 12, 17-24 (1998).</li><li>Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glass+bead+purification+of+plasmid+template+DNA+for+high+throughput+sequencing+of+mammalian+genomes.">Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes.</a> Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).</li><li>Levison, P. R., Badger, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+of+magnetic+beads+for+use+in+nucleic+acid+purification.">Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification.</a> J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).</li><li>Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+high-volume+extraction+method+for+viral+nucleic+acids+in+comparison+to+a+manual+procedure+with+preceding+enrichment.">Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment.</a> Vox Sang. 89, 71-76 (2005).</li><li>Perelle, S., Cavellini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robotic+RNA+purification+protocol+based+on+the+NucliSens+easyMAG+for+real-time+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus+in+bottled+water.">Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water.</a> J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).</li><li>Riemann, K., Adamzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+manual+and+automated+nucleic+acid+extraction+from+whole-blood+samples.">Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples.</a> J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).</li><li>Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+automated+sample+preparation+instrument+and+consumable+device+for+isolation+and+purification+of+nucleic+acids.">A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids.</a> J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).</li><li>Kessler, H., M&#252;hlbauer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+nucleic+acid+extraction.">Fully automated nucleic acid extraction.</a> MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).</li><li>Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+QIAGEN+automated+nucleic+acid+extraction+methods+for+CMV+quantitative+PCR+testing.">Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing.</a> Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).</li><li>Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+automated+nucleic+acid+extraction+methods+with+manual+extraction.">Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction.</a> J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).</li><li>Kruh&#248;ffer, M., Voss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+QIAsymphony+SP+workstation+for+magnetic+particle-based+nucleic+acid+purification+from+different+sample+types+for+demanding+downstream+applications.">Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications.</a> J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).</li><li>Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus,+system,+and+method+for+purifying+nucleic+acids.">Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids.</a> United States Patent. , (2010).</li><li>Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple+influenza+RNA+extraction+from+nasopharyngeal+samples.">Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples.</a> J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).</li><li>Chan, K. H., Lai, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+(H1N1).">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1).</a> J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).</li><li>Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analytical+sensitivities+of+six+rapid+influenza+A+antigen+detection+test+kits+for+detection+of+influenza+A.">Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A.</a> subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).</li><li>Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+diagnosis+of+fetal+aneuploidy+by+shotgun+sequencing+DNA+from+maternal+blood.">Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).</li></ol>

Авторы являются сотрудниками Akonni Biosystems, Inc, которые производят материалы, используемые в этой статье. Бесплатный доступ и производство этой статье проводится при финансовой поддержке Akonni Biosystems, Inc

Простота концепции TruTip и рабочий процесс (рис. 1) сделать его легко адаптировать, автоматизировать, эффективной и действенной для ряда клинических образцов матриц, объемы входной выборки, и жидких систем обработки. Следует признать, однако, что каждый клинический образец является уникальным, и будет меняться одного к другому в вязкости, частиц, слизи, поверхностных загрязнений, микробного и / или человеческого генетического фона. Учитывая ожидаемые изменения в области клинической состав образца и предполагаемое использование автоматизированный протокол пробоподготовки TruTip, поэтому может возникнуть необходимость в изменении определенные шаги в TruTip процедуры для достижения желаемых результатов для определенного типа образца. Независимо от типа образца, однако, TruTip параметров, которые обычно имеют наибольшее влияние на чистоту нуклеиновых кислот и / или восстановления включают: <ol><li> Пример перемешивания и гомогенизации буфером для лизиса (и алкоголя). TruTips Хотя есть повторноlatively большой размер пор, образец гомогенизации и сжижение очень важно для эффективного лизиса клеток и последующее связывание шага к TruTip монолит. С однородным и хорошо сжиженный лизата, образцы могут перемещаться по TruTip с более высокие скорости потока, что снижает общее время обработки образца. Большой объем плазмы протокол демонстрирует потенциал для пользователей, чтобы тщательно гомогенизации и сжижению трудно образцов (он-лайн или в автономном режиме), несмотря на большой объем входной выборки. </li><li> Расход. Более медленные темпы потока во время связывания нуклеиновых кислот или элюирования обычно приводят к более высоким выходом нуклеиновых кислот, хотя и за счет общего времени обработки. Более медленные темпы потока может также уменьшить степень ДНК стрижки. </li><li> Цикл чисел. Оптимальное количество и отказаться от стремления циклов зависит от типа образца, общий объем образца, и скорость потока. Шаг 1 на рисунке 1, как правило, точка, в которой цикл NumbeРТС (и скорости потока) может потребовать некоторых эмпирических оптимизации с образцов, таких как носоглоточной аспирации (рис. 5) представляет собой один из наиболее сложных лизатов оптимизировать за счет диапазоне вязкости ОПН из разных пациентов. </li><li> Сушка. Полное высыхание TruTip монолит является необходимым условием предотвращения остаточных органических растворителей из совместного элюированием смесью очищенного образца нуклеиновой кислоты и ингибирования последующих процессов или испытаний. Поскольку TruTip не сушится с помощью центрифугирования или вакуумной фильтрации, важно, чтобы максимизировать как скорость потока и цикл номера во время стадии сушки. Иногда возникают остаточные капли промывочного раствора на конец TruTip после цикла сушки будут завершены. Hamilton робот имеет возможность выполнить &quot;кончик касание&quot; на стороне скважины, чтобы освободить капли, тем самым обеспечивая растворителей элюирования. EpMotion системы не имеют этой функции, но предварительной промывки из TruTip концом в Эль-ution буфер может быть запрограммирован для достижения такого же эффекта. </li></ol> Поскольку геометрия, пипетки материала и способа крепления к роботизированных рук канала являются уникальными для каждого изготовителя прибора, различные конструкции TruTip требуется для каждой системы обработки жидкости. TruTip монолит размеры (диаметр, толщина и размер пор) коррелируют с нуклеиновой кислотой, связывающую способность (при элюировании эффективности), как ожидается для любого твердофазной экстракции техники. В то время как толстый (&gt; 4 мм) матрицы могут быть встроены в 1 мл TruTip увеличить нуклеиновой кислоты связывающей способности для больших объемов образцов и / или выравнивания способность к связыванию через специальные форматы TruTip, существует компромисс между толщиной TruTip и скорости потока при начальные стадии связывания (в присутствии сырой лизатов). Таким образом, иногда выгодно, чтобы встроить большего диаметра монолитов в больших объемах наконечники на начальных этапах автоматизированного протокола, (например, &lt;/ EM&gt; Гамильтон 5 мл / Akonni TruTips для больших объемов экстракции). С учетом конкретных конфигураций TruTip продиктовано производителей жидкость роботов обработки, однако, не обязательно ожидать TruTip нуклеиновые кислоты выход идентичными через жидкость платформы обработки различных производителей или разных размеров TruTip. Клинических образцов (по определению) будет содержать значительное количество геномной ДНК человека, если они не получены из стерильных в норме сайтов (например, спинномозговой жидкости). Иногда геномной ДНК человека нужен (как показано на рисунке 6), тогда как в других приложениях ДНК человека представляет собой нежелательный фон геномной (как рисунок 5). Присутствии фонового ДНК, как правило, не является проблемой, пока общее количество нуклеиновой кислоты в образце, не превышает способность к связыванию монолита, а фон ДНК может служить в качестве носителя, если желаемый целевой нуклеиновойкислота присутствует в следовых количествах. Целью большого объема плазмы протокола экстракции (рис. 7), чтобы изолировать (фрагментированные) ДНК плода в присутствии 10-20 кратного избытка материнской ДНК, которая похожа на цель пробоподготовки инфекционных заболеваний Тесты исключением того, что последовательностей очень конгруэнтно и может быть отличаются высокой специфичностью молекулярного тестирования и / или размер дискриминации. В этом случае общий циркулирующей ДНК выделяли с использованием 5 мл TruTip и последующее высокомолекулярный и низкомолекулярный ДНК плода разделены посредством последующего связывания и элюирования 1 мл TruTip, изменяя условия связывания буфера. Селективное разделение размер и обогащение нуклеиновых кислот-мишеней на основе их связывание и элюирование свойства монолита, является существенно различным механизмом действия, чем достигается за счет мембраны или размер колонки исключение спина. Разделение Размер и обогащение микробной ДНК из геномной ДНК человека может бытьccomplished в будущих приложений через настройки связывания TruTip и элюирования буферов. Автоматизированные протоколы продемонстрировали здесь подчеркнуть полезность TruTip монолит сам для обработки разнообразных клинических образцов, и как она может быть адаптирована для больших объемов и конкретных жидких роботов обращения. Обтекаемый методы обычно приводят к более быстрому добычи протоколов по сравнению с другими автоматизированными системами. Простота TruTip технологии, однако, также предоставляет некоторые преимущества в стоимости для тех, кто заинтересован в покупке нового, автоматизированная система очистки нуклеиновых кислот, так как основной аппаратных средств, необходимых для автоматизации процедур TruTip пипетки руку сам канал, а не магнитные стержни, вакуумные системы или бортовой центрифуги. Используя предварительно заполненные пластинами реагента может также уменьшить пространство и необходимые расходные материалы, и в два раза пропускную за один запуск. Минимизация палубе пространство с протоколами TruTip также предоставляет продвинутым пользователям возможность интегрировать выше или Downstream автоматизированных процессов с TruTip. Например easyBlood решение Гамильтона для фракционирования цельной крови могут быть включены с автоматизированным способом экстракции TruTip, что значительно упрощать био-банковских процессов. Постэкстракционный процессами, такими как нуклеиновые кислоты количественно, нормализация, ПЦР установка, или секвенирование ДНК также легко интегрируется с TruTip на больших платформах наливных.

Очистка нуклеиновых кислот необходимо для большинства молекулярной диагностики, исследований использования, и научных приложений жизни. Различные подходы появились с момента фенол / хлороформом, многие из которых основаны на фундаментальном принципе нуклеиновой кислоты связывания с диоксидом кремния в присутствии хаотропные соли 1. Процесс экстракции был упрощен и автоматизирован за счет использования различных бисером и мембранные форматов, со спином фильтры, магнитные шарики и связанных с ними подходов доминирующей отрасли науки о жизни (см. примеры в 2-13). В то время как эффективные, частицы и мембраны известные ограничения при столкновении со сложными клиническими матриц. Например, мембраны и шарик на основе столбцы соответствуют, имеют небольшие размеры пор (таким образом, высокое давление назад), а также требуют некоторого типа поддержки для того, чтобы быть обработана с помощью системы центрифуги или вакуума. Физические характеристики мембран и шарик результате столбцовзначительного жидкостного сопротивление, которое ограничивает тип образцов, которые могут быть эффективно обработаны без засорения расходные, и / или общее (вход) объем образца, который может быть одно-направленно обрабатываются через пути потока. С другой стороны, магнитные частицы должны быть распределены по всему образцу при перемешивании. Необходимость гомогенно распределять магнитные частицы в растворе ограничивает объем входной выборки, которые могут быть обработаны с наиболее магнитный валик расходных материалов. Клинические признаки образца (такие как вязкость и сложности) может привести к неэффективному концентрации магнитных частиц на стороне трубки или стержня. Кроме того, мелкие частицы кремнезема может разорвать из бисера в процессе извлечения, теряя свою намагниченность и загрязнения конечного образца. Технологии TruTip была разработана для преодоления некоторых из этих нуклеиновых кислот обработки образцов ограничений и ограничений 14. По вложения пористый монолит впипетки, жидкостный противодавление снижается, что позволяет управление потоком с помощью вакуума (т.е. стремление пипетки). Эта функция позволяет процесс добычи и Инструменты требующегося, чтобы очистить нуклеиновых кислот из сложных видов образцов значительно упростить (рис. 1). Геометрии и пористость монолита предназначена для минимизации засорения, а толщина монолита обеспечивает достаточную нуклеиновой кислоты связывающей способности для образца объемом от 1,0 до 5,0 мл. Двунаправленный поток во время аспирации и дозирования образца позволяет в течение длительного времени пребывания между экстрактом образца и связывания монолит для эффективного восстановления нуклеиновые кислоты и элюирования и обеспечивает относительно большие объемы образцов, подлежащих обработке, которые превышают объем емкости наконечник пипетки непосредственно. Ранее мы сообщили о разработке и применении процедуры ручной очистки TruTip гриппа РНК из носоглотки образцов с использованием одно-или многоканальные Райнин пипетки 15. Эквивалентная эффективность добычи были получены между автоматизированными QIAcube и методы руководства TruTip 10 6 копий генов гриппа на мл аспирата носоглотки. Целью данного исследования было продемонстрировать средней и высокой пропускной способностью, автоматизированные TruTip нуклеиновой кислоты процедур очистки носоглотки аспирация (НПД) и других клинически значимых типов образцов, с использованием жидких роботов обработки обычно встречаются в ссылки клинических лабораторий.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTip простой технологии нуклеиновых кислот посредством чего извлечение пористой монолитной связывания матрицы вставляется в наконечник пипетки. Геометрия монолита могут быть адаптированы для конкретных наконечники начиная объемом от 1,0 до 5,0 мл. Большой пористостью монолита позволяет вязких или сложные образцы легко проходить через него с минимальными жидкостный противодавления. Двунаправленный поток максимизирует время пребывания между монолитом и образец, и обеспечивает большие объемы образцов, подлежащих обработке в пределах одной TruTip. Основные шаги, независимо от объема образца или TruTip геометрии, включают лизиса клеток, нуклеиновые кислоты связывания с внутренней поры TruTip монолит, смывая несвязанных компонентов образца и лизис буфера, и элюирование очищенного и концентрируют нуклеиновых кислот в соответствующем буфере. Атрибуты и адаптивность TruTip демонстрируются в трех автоматизированных клиническом образце обработки протоколов, использующих epMotion Эппендорф 5070, Гамильтон звезда и STARPLUS жидких роботов обработки, в том числе выделение РНК из носоглотки аспирации, изоляции геномной ДНК из цельной крови и выделения ДНК плода и обогащение из больших объемов материнской плазме (соответственно).

ПЦР в реальном времени данных для гриппа РНК из NPA показаны на рисунке 5А. Оценка эффективности экстракции нуклеиновой кислоты аналогично результатам, полученным с ручным версии протокола 15. Линейный отклик в среднем C значений т наблюдается между 10 4 и 10 6 копий гена мл -1 поправки гриппа (R 2 = 0,99 и 0,98 гриппа А и В, соответственно), со стандартным отклонением в среднем C т значений менее 1 цикла. Отсутствие перекрестного загрязнения с epMotion системы показано на рисунке 5В, где 12 положительных образцов NPA, содержащий 10 6 копий гена мл -1 NPA чередовались с буфером из 12 заготовок. Средняя C T для положительного контроля был 30,16 ± 0,14, а все пробелы буфера были отрицательными. Общее время обработки образца 16, 28 и 40 мин в течение 8, 16 и 24 образцов соответственно.Потому что типичная клиническая носоглотки аспирата или тампон будет состоять из 10 7 копий гена мл -1 (при условии, 1000 вирионов в TCID 16 и 50&gt; 10 4 TCID 50 мл -1 гриппа 17), автоматизированный протокол epMotion как ожидается, будет эффективным на большинстве клинических образцов NPA. Учитывая диапазон молекулярных испытаний, выполненных на геномной ДНК человека, основной целью выделения нуклеиновых кислот из цельной крови является производство содержащем вредных веществ высокой молекулярной геномной ДНК веса. Автоматизированный протокол для 96 образцов завершается в течение 1 ч, что является улучшением по сравнению с другими автоматизированными системами (например, Promega MagneSil = 90 мин и Qiagen QIAamp ДНК крови BioRobot MDx система = 2,5 ч). Фиг.6А показан UV / Vis поглощение профили 45 положительных образцов крови обрабатываются одновременно с 45 реагента пустые графы в протоколе Гамильтона СТАР, в среднем <sub&gt; 260/280 Отношение 1,96 и средней 260/230 отношением 1,93. 260/280 соотношение между 1,7-2,0 и 260/230 соотношение&gt; 1,7, как правило, свидетельствует о очень чистой ДНК, свободный от остаточных солей, белков или растворители и приемлемо для большинства приложений молекулярной вниз. 1% агарозном геле на Фиг.6В показывает, что в результате гДНК является высокой молекулярной массы (&gt; 24 кб), с минимальным сдвига. Средний выход нуклеиновых кислот из полного набора 45 положительных образцов 5,26 ± 0,46 мкг ДНК человека в 200 мкл цельной крови, основанный на Quantifiler Life Technologies человека Kit Количественное ДНК. Перекрестное загрязнение исследования, аналогичные показанным на фиг.5В проводили с отрицательным контролем буфер заготовки перемежаются с положительных образцов и экстрагируют параллельно, и все заготовки снова были отрицательными методом ПЦР (не показано). Очищенный гДНК также подходит для многих других ПЦР-анализа (не показан). Результаты в реальном времени из восьми одинаковых образцов с пулом материнской образца плазмы обрабатывается с большим объемом TruTip процедуре, показано на рисунке 7. Полный протокол (в том числе автономно инкубации протеиназы К) завершена примерно 2,5 часа, похожие на Qiagen ручной Циркуляционный Нуклеиновые Кислоты Kit (не сопоставимы автоматизированные наборы извлечение пока недоступны). Среднее значение C T по всем повторяет являются 34,58 ± 0,66 и 29,76 ± 0,50 для мужчин плода (CHY) и общего (CH1) ДНК, соответственно, что демонстрирует отличную повторяемость автоматизированного метода экстракции. Концентрацию ДНК плода в общий пул ДНК (в геном эквивалентов), вычисляется на основе нужным сравнительный анализ указывает на стандартам, в результате средняя% плодной ДНК всех образцов на 2,8%. Фактический% фетальной ДНК для этого образца неизвестна, так как образцы объединяли перед проведением экстракции. Плод состав ДНКВ не-объединенных образцов плазмы экстрагировали с использованием TruTip метод, как правило, в 1,5 раза выше по сравнению с результатами с Qiagen Циркуляционный Нуклеиновые Кислоты Kit (не показан). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Рисунок 1. Процесс TruTip добычи и рабочего потока, независимо от жидкостной системы управления. Другие пробоподготовки или жидкого шагов обработки могут быть включены в автоматизированных процедур в зависимости от возможностей конкретного жидкость инструмент обработки и программное обеспечение. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Рисунок 2. (A) Эппендорф epMotion 5070 образца пластины макета. (B) Организация реагенты / ConsumaБлес на рабочем столе. образца пластины можно настроить до 24 образцов (столбцы 1, 5 и 9 соответственно), хотя epMotion будет обрабатывать не более 8 образцов одновременно. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Рисунок 3. Гамильтона СТАР палубе макета для очистки геномной ДНК из цельной крови (не в масштабе) Палуба Ступень 1 = Гамильтон 1 мл фильтруется советов;. 2 = Гамильтон 1 мл нефильтрованного советов; 3 = Akonni / Гамильтон 1 мл LPT 2 мм TruTips; 4 = вход крови носителей (сбора крови труб или труб микроцентрифужные); 5-9 = 290 мл реагента корыта для буфера для лизиса F, этанол, промывочного буфера J, K промывочного буфера и буфера для элюции A2 соответственно, 10 = 96 DЕЭП также Планшеты для связывания, 11 = 96 глубоких хорошо моются J, 12 = 96 глубоких хорошо моются К, 13 = 96 глубоких скважин элюирования пластину; 14 = Гамильтон HHS2 нагреватель / шейкер с Nunc 96 глубоких скважин пластины инкубации; 15 = 50 мл реагента корыта содержащего протеиназы К. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Рисунок 4. Hamilton STARPLUS палубе макета для очистки ДНК из большой объем образцов плазмы (не в масштабе). Система оснащена 8 × 5 мл каналов и 8 х 1 мл каналы (не показаны на палубе раскладки). Палуба Ступень 1 = Гамильтон 4 мл фильтруется советов, 2 = Akonni / Гамильтон 5 мл TruTips; 3 = образцов плазменного источника, 4 = 50 мл конические пробирки, 5 = 120 мл реагента желоба содержащие CN-W1, W2 CN-и CN-W4 reageНТС, 6 = низкого объема реагента желоба содержащего протеиназы К, CN-B2, CN-B3, EBA2, приливы и CN-W3 реагентов; 7 = 290 мл реагента корыта содержащие CN-L1 реагента, 8 = 290 мл реагента корыта содержащие CN Реагент-B1; 9 = 96 глубокими лунками для шага 1, 10 = 96 глубокими лунками на шаге 2, 11 = образца носителей для очищенных, конечный продукт; 12 = Гамильтон 1 мл нефильтрованного советы; 13 = Akonni / Гамильтон 1 мл LPT 4 мм TruTips. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Рисунок 5. (A). ПЦР в реальном времени результаты автоматизированное извлечение TruTip гриппа вирус, добавленный в носоглоточной аспирации (ННА). Входной NPA объем = 100 мкл, объем элюирования = 50 мкл. Результаты являются средними из 3 повторных электроннойxtractions из 5 различных фонов NPA (N = 15) за уровень разбавления и гриппа цель. кПЦР проводили на LightCycler 480 система с анализа условий, описанных ранее 15. (B) Нет перекрестного загрязнения не обнаружен, когда 12 положительных образцов NPA перемежаются с не шаблонные элементы управления и в соответствии с автоматизированной процедуры экстракции. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Рисунок 6. Результаты человеческой геномной экстракции ДНК из цельной крови.) УФ-видимый след от NanoDrop 1000 (ThermoFisher) из 10 случайно выбранных репликации. B) 1%-ном агарозном геле TruTip очищенный гДНК. M = 24 Кб Фишер Max DН.А. лестнице. Дорожки 1 - 4 = ~ 100 нг очищенного гДНК из четырех выбранных случайным образом повторяет. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Рисунок 7. ПЦР в реальном времени результатов из восьми повторных TruTip экстракции ДНК свободно циркулирует из плазмы. Образцы отмечены звездочкой (* или **) экстрагировали в отдельные дни. CHY количественно мужской ДНК плода и CH1 количественно общее данной ДНК (матери и плода). количественной ПЦР проводили на 480 системы LightCycler (Roche) с ранее опубликованными анализов ориентации CHY и CH1 18.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots at JoVE.com

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip простой технологии нуклеиновых кислот посредством чего извлечение пористой монолитной связывания матрицы вставляется в наконечник пипетки. Таким образом, формат подготовки образца совместим с большинством ликвидных инструментов обработки, и могут быть использованы для многих средней и высокой пропускной клинического применения и типов образцов.

Высокая пропускная способность, автоматизированное извлечение ДНК и РНК из клинических образцов TruTip использованием технологий на общей жидкостной обработки Роботы

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Bioengineering

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Комбинаторного синтеза и высокая пропускная способность белка Освобождение от полимерной пленки и наночастицы библиотеки

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: Высокая пропускная 96-Ну Платформа для измерения повреждений ДНК в Microarrayed клетках человека

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Автоматизированных роботов жидкой обработке Ассамблеи устройств модульной ДНК

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Оптимизация использования жидкого обработки робот провести высокой пропускной способности вперед химических генетики экран Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Оптимизация процесса с использованием высокой пропускной связи Автоматизированные микро-биореакторы в китайском Хомстер яичников культивирования клеток

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Высокая пропускная способность Дрожжи Штамм Фенотипирование с капли на основе РНК секвенирования

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...