Name: high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots at JoVE.com

Partes de este trabajo fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) en virtud de concesión R44 AI072784. Agradecemos al Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson y Amy Dean, del Laboratorio de Enfermedades Virales, Wadsworth Center, New York State Dept. de Salud de viriones de la gripe cuantificados y el acceso a la gripe en tiempo real clínicamente validado Los ensayos de PCR.

<ol>
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Los autores son empleados de Akonni Biosystems, Inc., que producen los materiales utilizados en este artículo. Acceso libre y Producción de este artículo está patrocinado por Akonni Biosystems, Inc.

La simplicidad del concepto TruTip y flujo de trabajo (Figura 1) que sea fácilmente adaptado, automatizado, eficiente y eficaz para un número de matrices de muestras clínicas, los volúmenes de muestra de entrada, y los sistemas de manejo de líquidos. Debe reconocerse, sin embargo, que cada muestra clínica es único, y pueden variar uno al siguiente en la viscosidad, partículas, moco, contaminantes de la superficie, microbianos, y / o fondos genéticos humanos. Teniendo en cuenta las variaciones esperadas en la composición de la muestra clínica y usos previstos de un protocolo de preparación de la muestra TruTip automatizado, para ello puede ser necesario modificar algunos pasos en un procedimiento TruTip con el fin de lograr los resultados deseados para un tipo de muestra específica. Independientemente del tipo de muestra, sin embargo, los parámetros de TruTip que típicamente tienen el impacto más significativo sobre la pureza del ácido nucleico y / o de recuperación incluyen: <ol><li> Ejemplo de mezcla y homogeneización con tampón de lisis (y el alcohol). Mientras TruTips tienen una retamaño de poro lativamente grande, homogeneización de la muestra y la licuefacción es muy importante para la lisis celular eficaz, y etapas de unión posteriores a la TruTip monolito. Con un lisado homogénea y bien licuado, las muestras pueden moverse a través de la TruTip con caudales más altos, lo que reduce el tiempo total de procesamiento de la muestra. El protocolo de plasma de gran volumen demuestra el potencial de los usuarios para homogeneizar bien y licuar muestras difíciles (on-line u off-line), a pesar del gran volumen de la muestra de entrada. </li><li> Las velocidades de flujo. Tasas de flujo más lento durante la unión a ácido nucleico o elución suelen dar lugar a mayores rendimientos de ácido nucleico, aunque a expensas de tiempo de procesamiento total. Las tasas de flujo más lento también pueden reducir el grado de cizallamiento de ADN. </li><li> Los números de ciclo. El número óptimo de ciclos de aspiración y dispensación depende de tipo de muestra, el volumen total de la muestra, y las tasas de flujo. Paso 1 en la figura 1 es normalmente el punto en el que Numbe ciclors (y velocidades de flujo) puede requerir alguna optimización empírica, con muestras tales como aspirado nasofaríngeo (Figura 5), que representa uno de los lisados ​​más desafiantes para optimizar debido a la gama de viscosidades NPA de diferentes pacientes. </li><li> Secado. Secado completo de la TruTip monolito es imperativo para evitar disolventes orgánicos residuales procedentes de la co-eluyendo con la muestra purificada de ácido nucleico y la inhibición de los procesos aguas abajo o pruebas. Debido a TruTip no se seca a través de centrifugación o filtración al vacío, es importante para maximizar tanto la velocidad de flujo y los números de ciclo durante la etapa de secado. A veces hay una gota residual de la solución de lavado en el término de TruTip después de completar los ciclos de secado. El Hamilton robot tiene la capacidad de realizar una &quot;punta toque&quot; en el lado del pozo para liberar la gota, garantizando así una elución libre de disolvente. El sistema de epMotion no tiene esta característica, sino una pre-enjuague del terminal TruTip en ellución tampón puede ser programado para lograr el mismo efecto. </li></ol> Debido a la geometría, material de la punta de pipeta, y el método de fijación de los brazos robóticos de canal son únicos para cada fabricante de instrumentos, se requiere una construcción TruTip diferente para cada sistema de manejo de líquidos. Las dimensiones monolito TruTip (diámetro, grosor y tamaño de poro) se correlacionan con la capacidad de unión a ácido nucleico (y las eficiencias de elución), como se espera que para cualquier técnica de extracción en fase sólida. Si bien gruesas matrices (&gt; 4 mm) se pueden incrustar en un TruTip 1 ml a aumentar la capacidad de unión a ácido nucleico para muestras de gran volumen y / o igualar la capacidad de unión a través de formatos de TruTip específicas, hay un equilibrio entre el espesor de TruTip y velocidades de flujo durante la etapa de unión inicial (en la presencia de lisados ​​crudos). Por lo tanto, a veces es ventajoso incorporar monolitos de mayor diámetro en la punta de la pipeta de mayor volumen para las etapas iniciales de un protocolo automatizado (por ejemplo &lt;/ Em&gt; los ml Hamilton / Akonni TruTips 5 de extracciones a gran volumen). Dadas las configuraciones TruTip específicas dictadas por los fabricantes de robots de manipulación de líquidos, sin embargo, no necesariamente esperamos rendimientos de ácido nucleico TruTip sean idénticos en todas las plataformas de manejo de líquidos de diferentes fabricantes, o en diferentes tamaños TruTip. Las muestras clínicas (por definición) contendrán cantidades significativas de ADN genómico humano a menos que se adquieren a partir de sitios normalmente estériles (por ejemplo líquido cefalorraquídeo). A veces se desea el ADN genómico humano (como en la Figura 6), mientras que en otras aplicaciones el ADN humano representa un fondo genómico no deseados (como para la Figura 5). La presencia de ADN de fondo no suele ser problemático, ya que siempre que la cantidad total de ácido nucleico en la muestra no exceda la capacidad de unión del monolito, y el ADN de fondo puede servir como un portador si la nucleico diana deseadaácido está presente en cantidades traza. El objetivo del protocolo de extracción de plasma de gran volumen (Figura 7) es para aislar (fragmentado) ADN fetal en presencia de un exceso de 10-20 veces de ADN materno, que es similar a la preparación de la muestra objetivo de las pruebas de enfermedades infecciosas, excepto que las secuencias son muy congruentes y sólo se pueden distinguir por las pruebas moleculares altamente específica y / o tamaño de la discriminación. En este caso, el ADN circulante total se aisló utilizando un TruTip 5 ml, y ADN fetal de alto peso molecular y de bajo peso molecular posterior se separan en la posterior unión y elución a un ml TruTip 1 mediante la alteración de las condiciones de tampón de unión. Tamaño de la separación y el enriquecimiento selectivo de los ácidos nucleicos diana sobre la base de sus propiedades de unión y elución a un monolito de sílice es un modo significativamente diferente de acción que la conseguida por membranas o columnas de centrifugado de exclusión por tamaño. Tamaño separación y enriquecimiento de ADN microbiano a partir de ADN genómico humano pueden ser unaccomplished en aplicaciones futuras a través de la personalización de tampones de elución de unión y TruTip. Los protocolos automatizados demostraron aquí hincapié en la utilidad de la TruTip sí mismo monolito para el procesamiento de diversas muestras clínicas, y cómo puede ser adaptado para grandes volúmenes y los robots de manejo de líquidos específicos. Los métodos simplificados suelen dar lugar a protocolos de extracción más rápido en comparación con otros sistemas automatizados. La simplicidad de la tecnología TruTip, sin embargo, también ofrece algunas ventajas de costes para los interesados ​​en la compra de un nuevo sistema de purificación de ácidos nucleicos automatizada,, porque el hardware primaria requerida para la automatización de los procedimientos de TruTip es el brazo pipeta propio canal en lugar de varillas magnéticas, sistemas de vacío , oa bordo de centrifugadoras. La utilización de placas de reactivos precargados también puede reducir el espacio y consumibles necesarios, y el doble de rendimiento por ciclo. Minimizar el espacio de la cubierta con los protocolos TruTip también permite a los usuarios avanzados la integración aguas arriba o aguas dprocesos automatizados ownstream con la TruTip. Por ejemplo solución easyBlood de Hamilton a la sangre completa fraccionar puede incorporarse con el método de extracción TruTip automatizada, lo que agilizar significativamente los procesos bio-banking. Los procesos de post-extracción tales como la cuantificación de ácido nucleico, la normalización, la PCR configuración, o la secuenciación de ADN también se integran fácilmente con TruTip en las plataformas de manejo de líquidos más grandes.

Purificación de ácidos nucleicos es necesario para el diagnóstico molecular más, la investigación sólo utilizar, y aplicaciones de ciencias de la vida. Varios enfoques han surgido desde el momento de extracciones con fenol / cloroformo, muchos de los cuales se basan en el principio fundamental de la unión de ácidos nucleicos a la sílice en presencia de sales caotrópicas 1. El proceso de extracción se ha simplificado y automatizado a través del uso de diversos formatos-y el talón basados ​​en membranas, con filtros de espín, perlas magnéticas y enfoques relacionados que dominan la industria de ciencias de la vida (ver ejemplos en 2-13). Aunque eficaz, las partículas y las membranas han sabido limitaciones cuando se enfrentan a difíciles matrices clínicos. Por ejemplo, las membranas y columnas basados ​​en perlas son compatibles, tienen pequeños tamaños de poro (por lo tanto, altas presiones de la espalda), y requieren algún tipo de apoyo con el fin de ser procesados ​​por un sistema de centrífuga o de vacío. Las características físicas de las membranas y columnas de perlas de resultado enresistencia fluídica significativa, lo que limita el tipo de muestras que se puede procesar de manera eficiente sin obstruir el consumible, y / o el volumen total de la muestra (entrada) que pueden ser uni-direccionalmente procesado a través de la trayectoria de flujo. Por el contrario, las partículas magnéticas deben ser distribuidas a lo largo de la muestra por agitación. La necesidad de distribuir homogéneamente las partículas magnéticas dentro de una solución limita el volumen de la muestra total de entrada que puede ser procesado con los consumibles de talón más magnéticos. Atributos de muestras clínicas (tales como la viscosidad o la complejidad) pueden conducir a la concentración de partículas magnéticas ineficiente en el lado de un tubo o varilla. Además, las partículas finas de sílice pueden desprenderse de las cuentas durante el proceso de extracción, perdiendo su magnetización y la contaminación de la muestra final. La tecnología TruTip fue desarrollado para superar algunas de estas limitaciones de ácidos nucleicos de muestra y limitaciones de procesamiento 14. Mediante la incorporación de un monolito poroso dentro de unpunta de la pipeta, contrapresión de fluido se reduce, lo que permite el control de flujo de vacío (es decir, una pipeta de aspiración). Esta característica permite que el proceso de extracción y de la instrumentación requerida para purificar ácidos nucleicos a partir de los tipos de muestras difíciles de ser simplificado en gran medida (Figura 1). La geometría y la porosidad del monolito se adapta para reducir al mínimo la obstrucción, mientras que el espesor del monolito proporciona la capacidad de unión de ácido nucleico suficiente para volúmenes de muestra que van de 1,0 a 5,0 ml. De flujo bidireccional de la muestra durante la aspiración y la dispensación permite tiempos de residencia prolongados entre el extracto de la muestra y el monolito de unión para la recuperación de ácido nucleico eficiente y elución, y permite relativamente grandes volúmenes de muestra para ser procesada que exceda la capacidad de volumen de la propia punta de la pipeta. Hemos informado anteriormente de la elaboración y aplicación de un procedimiento TruTip manual para purificar ARN influenza en muestras nasofaríngeas utilizando un único o multi-canal Rainin pipeta 15. Eficiencia de extracción equivalentes se obtuvieron entre automatizado QIAcube y métodos TruTip manuales a 10 6 copias de genes de influenza A por ml aspirado nasofaríngeo. El objetivo de este estudio fue demostrar, procedimientos de mediano y alto rendimiento automatizadas TruTip purificación de ácidos nucleicos de aspirado nasofaríngeo (NPA) y otros tipos de muestras clínicamente relevantes, utilizando robots de manipulación de líquidos que se encuentran comúnmente en los laboratorios clínicos de referencia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-11120</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99% Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270725-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 30 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well plate 96/2,000 &mu;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>30502302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &mu;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>960050100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epMotion 5070 System</td>
			<td rowspan="3">Eppendorf</td>
			<td>5070 000.000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing tool TM1000-8</td>
			<td>960001061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir rack</td>
			<td>960002148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>300-20341</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC615110040</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235905</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Trough</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well 2 ml plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 DWP-2 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>27874</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Trough</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton STAR System</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173027</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml 96-channel head</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Carriers/Inserts</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400/182238</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHS2 Heater Shaker Unit</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>199033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td>
			<td>Akonni Biosystems, Inc.</td>
			<td>Call to inquire</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459828-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC327270010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AMRESCO LLC</td>
			<td>E195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered 4 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184022</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unfiltered 1 ml Tips</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>235939</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Deep Well Plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1896-2800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Corning/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-526B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>187297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182703</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Volume 96-Pos Reagent Troughs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-222-412</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173025/190012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Independent Pipette Channels / Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173081/173052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Independent Channel / Modular Arm</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>184090/173050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182090</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiflex Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>188047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ml Reagent trough carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>185290</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182085</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Tube Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>182245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Position Sample Carriers</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 Position Sample Carrier</td>
			<td>Hamilton Robotics, Inc.</td>
			<td>173410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, automated extraction of dna and rna from clinical samples using trutip technology on common liquid handling robots

TruTip es una tecnología de extracción de ácidos nucleicos muy simple por la unión de la matriz porosa, monolítica se inserta en una punta de pipeta. La geometría del monolito puede ser adaptado para puntas de pipeta específicas que varían en volumen de 1,0 a 5,0 ml. La gran porosidad del monolito permite muestras viscosas o complejo para pasar fácilmente a través de él con contrapresión de fluido mínima. Flujo bidireccional maximiza el tiempo de residencia entre el monolito y la muestra, y permite a las grandes volúmenes de muestra para ser procesada dentro de un solo TruTip. Los pasos fundamentales, independientemente de su volumen de la muestra o la geometría TruTip, incluyen la lisis celular, unión de ácidos nucleicos a los poros interiores de la TruTip monolito, lavando componentes de la muestra no unidos y tampones de lisis, y eluir los ácidos nucleicos purificados y se concentró en un tampón apropiado. Los atributos y la adaptabilidad de TruTip se demuestran en tres protocolos de procesamiento de muestras clínicas automatizadas utilizando un Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR y STARPLUS robots de manipulación de líquidos, como el aislamiento de ARN de aspirado nasofaríngeo, el aislamiento de ADN genómico a partir de sangre total, y la extracción de ADN fetal y el enriquecimiento de grandes volúmenes de plasma materno (respectivamente).

Datos de PCR en tiempo real para la gripe extracción de RNA de NPA se muestran en la Figura 5A. Estima que la eficacia de extracción de ácido nucleico es similar a los resultados obtenidos con la versión manual del protocolo 15. Una respuesta lineal en promedio valores C t se observa entre 10 4 y 10 6 copias del gen ml -1 modificado influenza (R 2 = 0,99 y 0,98 para la influenza A y B, respectivamente), con desviaciones estándar en media C t valores inferiores a 1 ciclo. La ausencia de contaminación cruzada con el sistema de epMotion se demuestra en la Figura 5B, donde 12 muestras NPA positivas que contienen 10 copias del gen 6 ml -1 NPA se intercalan con 12 espacios en blanco tampón. El promedio de C t para los controles positivos fue 30,16 ± 0,14, y todos los espacios de amortiguamiento fueron negativos. El tiempo total de procesamiento de la muestra es 16, 28 y 40 min para 8, 16 y 24 muestras, respectivamente.Debido a que una típica aspirado nasofaríngeo clínica o un hisopo contendrán 10 7 gen copias ml -1 (suponiendo 1000 viriones por TCID 50 y 16&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 gripe 17), se espera que el protocolo de epMotion automatizado para ser eficaz en la mayoría de especímenes clínicos NPA. Teniendo en cuenta la gama de pruebas moleculares realizados sobre el ADN genómico humano, el objetivo principal de extracción de ácidos nucleicos de la sangre entera es para producir ADN genómico libre de contaminantes, de alto peso molecular. El protocolo automatizado para 96 muestras se completa en 1 hora, que es una mejora con respecto a otros sistemas automatizados (por ejemplo, Promega MagneSil = 90 min y Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot sistema MDx = 2,5 h). Figura 6A muestra los perfiles de absorbancia de UV / VIS para 45 muestras de sangre positivas procesados ​​simultáneamente con 45 espacios en blanco de reactivos en el protocolo de Hamilton STAR, con un promedio Un <sub&gt; 260/280 proporción de 1.96 y el promedio de una relación de 260/230 de 1,93. Una relación A 260/280 entre 1,7-2,0 y A 260/230 ratio&gt; 1,7 son generalmente indicativos de ADN muy puro, libre de sales residuales, proteínas o disolventes, y aceptable para aplicaciones moleculares más abajo. El gel de agarosa al 1% en la Figura 6B muestra que el gDNA resultante es de alto peso molecular (&gt; 24 kb), con cizallamiento mínima. El rendimiento promedio de ácido nucleico a partir de todo el conjunto de 45 muestras positivas es de 5,26 ± 0,46 g ADN humano por 200 l de sangre entera, sobre la base de las Tecnologías de Quantifiler kit de cuantificación de ADN humano vida. Estudios de contaminación cruzada similares a los mostrados en la Figura 5B se realizaron con espacios en blanco tampón de control negativo intercalados con las muestras positivas y se extrajo en paralelo; todos los espacios en blanco volvieron a ser negativos por PCR (no se muestra). El purificado ADNg también es adecuado para otros numerosos análisis basados ​​en la PCR (no se muestra). Resultados en tiempo real de ocho muestras repetidas de una muestra de plasma de la madre agrupado procesado con el procedimiento TruTip de gran volumen se muestran en la Figura 7. El protocolo completo (incluyendo fuera de línea proteinasa K de incubación) se terminó en aproximadamente 2,5 horas, similar a la del manual de circulación Kit de Qiagen Nucleic Acids (no comparables kits de extracción automatizados están disponibles aún). El promedio de los valores C t más de todas las repeticiones son 34,58 ± 0,66 y 29,76 ± 0,50 para el varón fetal (CHi) y el total de ADN (CH1), respectivamente, lo que demuestra una excelente repetibilidad del método de extracción automatizado. La concentración de ADN fetal dentro de la piscina total de ADN (en equivalentes de genoma), se calcula sobre la base de análisis de punto de comparación ajuste a las normas, con la media% ADN fetal resultante a través de todas las muestras de 2,8%. El ADN fetal% real para esta muestra es desconocido porque las muestras se agruparon antes de realizar la extracción. Composición de ADN fetalen muestras de plasma no agrupados extraídos utilizando el método TruTip son típicamente 1,5 veces mayor en comparación con los resultados con una circulación Kit de Qiagen Nucleic Acids (no se muestra). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figura 1. El proceso de extracción TruTip y el flujo de trabajo, independientemente del sistema de manejo de líquidos. Otros preparación de la muestra o los pasos de manipulación de líquidos se pueden incorporar en las rutinas automatizadas dependiendo de las capacidades del instrumento de manipulación de líquidos y software específicos. <img alt="La figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 muestra de diseño de la placa. (B) Disposición de los reactivos / Consumables en la mesa de trabajo. La placa de la muestra se pueden configurar para un máximo de 24 muestras (columnas 1, 5 y 9, respectivamente), aunque el epMotion sólo procesará un máximo de 8 muestras simultáneamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figura 3. Hamilton ESTRELLA disposición de la cubierta para la purificación de ADN genómico a partir de sangre entera (no a escala) Cubierta Posición 1 = Hamilton 1 ml consejos filtrados;. 2 = Hamilton 1 ml sugerencias no filtrados; 3 = Akonni / Hamilton ml LPT TruTips mm 1 2 4; = entrada de soporte de muestras de sangre (tubos de recogida de sangre o tubos de microcentrífuga); 5-9 = 290 ml depresiones reactivas para Lysis Buffer F, el etanol, el tampón de lavado J, K tampón de lavado y elución Buffer A2, respectivamente, 10 = 96 deep placa de unión; 11 = 96 pozo profundo Lave J, 12 = 96 pozo profundo Lavar K, 13 = 96 plato hondo elución bien; 14 = Hamilton HHS2 calentador / agitador con Nunc 96 plato hondo de incubación bien, 15 = 50 ml a través de reactivos conteniendo proteinasa K. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> La Figura 4. Hamilton STARPLUS disposición de la cubierta para la purificación de ADN a partir de muestras de plasma de grandes volúmenes (no a escala). El sistema está equipado con 8 canales x 5 ml y 8 canales x 1 ml (no se muestra en la disposición de la cubierta). Cubierta Posición 1 = Hamilton 4 consejos ml filtradas; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = muestras de plasma de origen; 4 = tubos cónicos de 50 ml, 5 = 120 depresiones reactivas ml con CN-W1, W2 y CN-CN-W4 Reagetes, 6 = bajo volumen depresiones reactivas que contienen proteinasa K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB y CN-W3 reactivos; 7 = 290 ml a través de reactivos que contiene reactivo CN-L1; 8 = 290 ml a través de reactivos que contiene CN -B1 reactivo; 9 = 96 placas de pocillos profundos para el Paso 1, 10 = 96 placas de pocillos profundos para el Paso 2, 11 = portadores de muestra para purificado, producto final; 12 = Hamilton de 1 ml puntas sin filtro; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figura 5. (A). En tiempo real los resultados de PCR de extracción TruTip automatizado de virus de la gripe agregados en aspirado nasofaríngeo (NPA). Entrada de volumen NPA = 100 l, volumen de elución = 50 l. Los resultados son la media de 3 replicar extractions de 5 diferentes fondos NPA (n = 15) por nivel de dilución y de destino influenza. qPCR se realizó en el sistema LightCycler 480 con las condiciones de ensayo descritas anteriormente 15. (B) se detectó la contaminación cruzada al 12 muestras positivas NPA se entremezclan con la plantilla no controles y sujetos al procedimiento de extracción automatizada. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> La Figura 6. Resultados de la extracción de ADN genómico a partir de sangre humana entera. A) Las trazas UV-visible desde 1000 NanoDrop (ThermoFisher) de 10 seleccionados al azar repeticiones. B) 1% en gel de agarosa de TruTip purificada gDNA. M = Fisher 24 kb Max DLadder NA. Los carriles 1 - 4 = ~ 100 ng purificada gDNA de cuatro seleccionados al azar repeticiones. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figura 7. En tiempo real los resultados de PCR de ocho replicar TruTip extracciones de libre circulación de ADN de muestras de plasma. Denotados con un asterisco (* o **) se extrajeron en días separados. CHY cuantifica ADN fetal masculino y CH1 cuantifica ADN total presente (fetal y materna). qPCR se realizó en un sistema LightCycler 480 (Roche) con los ensayos previamente publicados dirigidos CHY y CH1 18.

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High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip es una tecnología de extracción de ácidos nucleicos muy simple por la unión de la matriz porosa, monolítica se inserta en una punta de pipeta. Por consiguiente, el formato de preparación de la muestra es compatible con la mayoría de instrumentos para la manipulación de líquidos, y se puede utilizar para muchos medio a las aplicaciones clínicas de alto rendimiento y tipos de muestras.

De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

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