Name: a novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00
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Wir möchten Andrea Portbury für die kritische Durchsicht des Manuskripts und die NIH (grant # R01HL061656) für finanzielle Unterstützung danken.

1. Herausschneiden der embryonalen Herzen <ol><li> Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus an der gewünschten embryonalen Tag mit einem zugelassenen Euthanasie Technik. Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt. </li><li> Liberally sprühen die weiblichen mit 70% Ethanol vor Dissektion. Öffnen Sie den weiblichen Bauchhöhle abzurufen und Verbrauchsteuern die Uterushorns. </li><li> Legen Sie die Uterushorns in eine Petrisc...

<ol>
	<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. 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Die aktuelle Kultur-System stellt erhebliche Vorteile für die embryonale Maus Herz Studien. Diese Kultur-System bewahrt Kontraktilität und die koronare Plexus, mit begrenzten Zeichen der Nekrose, auch nach vier Tagen in Kultur. Ferner stellt die halbfeste Matrix genug Unterstützung, um die dreidimensionale Morphologie der Entwicklung von Herz zu halten, während eine Flexibilität bis zum Vertragsabschluss und auch beschichtete Kügelchen in Position zu halten, während der Kultur. Trotz dieser Unterstützung ist die...

In den letzten Jahren hat sich die transgene Maus die vorherrschende Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung Herzfehler. Aber auch andere Modell Organismen, wie zum Beispiel dem Zebrafisch, erwiesen erhebliche Vorteile gegenüber der Maus haben. Drei wichtige Vorteile der Zebrafisch sind die externen Eiablage zur Erleichterung des Zugangs zu den Embryonen, die optische Transparenz der Embryonen, die einen einfachen Visualisierung der kardialen Entwicklung ermöglicht, und die Leichtigkeit der Anwendung niedermolekulare Behandlungen zu modulieren Entwicklung des Embryos 1. Somit würde die Entwicklung einer Technik, die ex utero Wachstum eines embryonalen Organ erlaubt umgehen, wenigstens teilweise die Grenzen forschungsaktuell Studium Entwicklungsprozesse in transgenen Mäusen erfahren. Ex vivo kardialen Kultur-Systeme sowohl in der Küken und Maus-Embryo entwickelt, ermöglichen die Behandlung mit kleinen Molekülen und Analyse der verschiedenen Regionen des Herzens kommunizieren 2-6. Für ganze Maus Herz kultur, herzen von Embryonen bis zu embryonalen genommen (E) 12.5 Alter kann in Kulturmedium mit oder ohne rocking 2,3,5 platziert werden. Mit dieser Technik haben embryonalen Herzen erfolgreich auf die Gleichwertigkeit der E13.5 inkubiert und Herzen mit rocking kultiviert wurden so lange wie drei Tage (ab E10.5) 3 erhalten. Es wurden jedoch keine Studien die erfolgreiche Kultur der Herzen von älteren Embryonen berichtet. Ebenso wurden Experimente rescue dem Aufbringen des therapeutischen Mittels global zu dem Kulturmedium 2 begrenzt. Ein Stück Kultur, bei dem Herzen ausgeschnitten, eingebettet sind, und im Schnitt mit einem Vibratom hat auch für jüngere Herzen wie E12.5 Maus Herzen und Hamburger-Hamilton Stufe 36 (etwa E16 in der Maus) Küken Herzen ausgenutzt 2,4,6 und ältere Herzen, wie postnatalen und adulten Maus heARTS und erwachsenen menschlichen Herzen 7,8. Während die embryonalen Analysen typischerweise 150 um dicke Abschnitte 2,4 genutzt haben, können eine große Schnittdicke als 500 um betragen ohne Nachweis von Sauerstoffmangel 8. Diese Scheibe Kulturen haben so lange wie zwei Monate in Kultur gehalten wurden, mit den meisten Scheiben Aufrechterhaltung Kontraktilität während dieser Zeit 9. Im Vergleich zu Studien in isolierten Herzmuskelzellen, erlauben diese Scheibe Kulturen der Co-Kultur von Herzmuskelzellen mit ihren benachbarten Zelltypen und eine nützliche Methode zur ex vivo Analyse. Jedoch erfordern diese Kulturen aufwendiger Satzes als einfach dadurch ein Herz in Kulturmedium (zB Einbetten des lebenden Herzen zum Schneiden auf einem Vibratom), und eine Analyse ist offensichtlich auf den Teil des Herzens innerhalb des Abschnitts begrenzt. Angesichts der oben beschriebenen Einschränkungen für die Kultivierung embryonaler Maus Herzen und der Fülle von transgenen Mäusen available für Studie haben wir eine Ex-vivo-Maus Herz Kultur-System ähnlich wie ein ex vivo Lungen-Kultur-System von Weaver entwickelt zu werden, ermöglicht et al. Unsere Kultur 10 System langfristig Kultur und Visualisierung der Umbau Koronarzirkulation innerhalb ganzen embryonalen Maus Herzen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Matrigel Perlen in in der Nähe des Herzens gehalten werden, wodurch eine lokalisierte Behandlung mit therapeutischen Mitteln. Diese Versuche können in verschiedenen Entwicklungsstadien Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf ein Verfahren wie koronare Bildung zu vergleichen. Da kleine Moleküle durch Matrigel diffundieren kann, kann dieses Kultursystem auch zur Kultur präpariert Regionen des Herzens in der Nähe zueinander, um zu bestimmen, ob bestimmte Zell-Zell-Kontakte, die für bestimmte Entwicklungsprozesse oder ob parakrine Signalisierung von einem Bereich zum anderen ist es verwendet werden erforderlich. Diese Kultur-Systemist relativ einfach und im Gegensatz zur Scheibe Kultur-System, nutzt grundlegende Kultur Reagenzien und Set-ups, die leicht verfügbar in den meisten Labors sind. Kurz gesagt, werden herausgeschnitten embryonalen Herzen in verdünnter Matrigel, das eine semi-festen Träger enthält, kultiviert. Diese Unterstützung ausreichend ist, um die dreidimensionale Morphologie des Herzens befindet und ermöglicht gleichzeitig das Herz kontrahiert. Mit diesem System können ganze Herzen von älteren Maus-Embryonen (E14.5-E16.5) in Kultur für bis zu vier Tage gehalten werden. Die gesamte koronare Plexus aufrechterhalten wird, anders als in den Schnittkulturen, so dass alle Signal-Signale, die von verschiedenen Regionen des Herzens auftreten vorhanden bleiben. Darüber hinaus können in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe durchdringen die Matrigel bis zur Visualisierung der Live-Herzen zu ermöglichen, und Protein-konjugierten Perlen können in der Nähe des Herzens platziert werden, um eine lokalisierte Signalisierung Quelle bereitzustellen. Zusammen machen diese Vorteile diese Technik eine ideale Methode zur Untersuchung Entwicklungsprozesse im Embryoic Maus Herz.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timed-pregnant mice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS (1x)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Cellgro </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>F2442 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
 <td>BD Bioscience </td>
 <td>356231 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto-16</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>S7578 </td>
 <td>Used as directed in 13 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well culture plate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>07-200-84</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereoscopic microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ645</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture incubator</td>
 <td>Thermo </td>
 <td>3110 </td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

a novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart

Developmental Studien in der Maus durch die Unzugänglichkeit des Embryos während der Schwangerschaft behindert. So, um Protokolle zu isolieren und Kultur einzelner Organe von Interesse sind unerlässlich, um ein Verfahren zur Visualisierung von Veränderungen sowohl in der Entwicklung und ermöglicht neuartige Behandlungsstrategien bieten. Um die langfristige Kultur der embryonalen Herzen im späten Stadien der Schwangerschaft zu fördern, haben wir ein Protokoll, in dem die ausgeschnittene Herz in einem semi-solid, verdünnter Matrigel kultiviert wird. Dieses Substrat bietet genug Unterstützung, um die dreidimensionale Struktur zu erhalten, ist aber flexibel genug, um anhaltende Kontraktion zu ermöglichen. Kurz Herzen sind aus dem Embryo herausgeschnitten und in einem Gemisch aus kaltem Matrigel 1:1 mit Wachstumsmedium. Nach dem verdünnten Matrigel erstarrt, wird das Wachstum mittel-bis der Kulturschale gegeben. Herzen so spät wie embryonalen Tag 16,5 herausgeschnitten lebensfähig waren für vier Tage nach der Präparation. Analyse der koronaren Plexus zeigt, dass dieses Verfahren nicht der Fall iststören koronaren vaskulären Entwicklung. So stellen wir eine neue Methode für die langfristige Kultur von embryonalen Herzen.

Unter Verwendung dieser Technik das Herz seine dreidimensionale Morphologie erhält und lebensfähig bleibt, wie durch fortgesetzte Kontraktionen (Movie 1). Diese Kontraktionen sind durchweg mehr im Vordergrund als in den Vorhöfen in die Herzkammern. Nach Kultur, kann Herzen fixiert und entweder für Immunohistochemie oder Histologie Marker-Expression oder Strukturen untersuchen verarbeitet werden. 1A zeigt den Boden der Kammern und der großen Arterien eines embryonalen Maus Herz, das...

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A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental Studien in der Maus durch die Unzugänglichkeit des Embryos während der Schwangerschaft behindert. Um die langfristige Kultur der embryonalen Herzen im späten Stadien der Schwangerschaft zu fördern, haben wir ein Protokoll, in dem die ausgeschnittene Herz in einem semi-solid, verdünnter Matrigel kultiviert wird.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Eine neue Methode für die Kultur und polarisierte Stimulation der menschlichen Darmschleimhaut Explantate

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...