Name: a novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Andrea Portbury for kritisk lesing av manuskriptet og NIH (tilskudd # R01HL061656) for finansiering støtte.

En. Excising de embryonale Hearts <ol><li> Avlive en tidsstyrt gravid musen på ønsket embryonale dag med en godkjent dødshjelp teknikk. Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of North Carolina at Chapel Hill. </li><li> Liberalt spray kvinne med 70% etanol før disseksjon. Åpne kvinnens bukhulen for å hente og avgiftsdirektoratet livmor horn. </li><li> Plasser uterine horn i en petriskål inneholdende kald 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) og skyll etter behov. Klipp...

<ol>
	<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF-BMP+signaling+axis+regulates+outflow+tract+valve+primordium+formation+by+promoting+cushion+neural+crest+cell+differentiation.">The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation.</a> Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation.">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5, 62-66 (2009).</li><li>Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+contractile+characteristics+of+human+myocardium+in+multi-day+cell+culture.">Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).</li><li>Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+and+Fgf10+play+opposing+roles+during+lung+bud+morphogenesis.">Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis.</a> Development. , 127-2695 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiac Development. , (2007).</li><li>Arima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Den nåværende kultur-systemet utgjør betydelige fordeler for embryonale mus hjerte studier. Denne kulturen system bevarer hjertets kontraktilitet og koronar plexus, med begrensede tegn på nekrose, selv etter fire dager i kultur. Videre tilveiebringer den halvfaste matriks tilstrekkelig støtte til at vedlikeholde den tredimensjonale morfologi av utvikling av hjertesykdom, samtidig som fleksibiliteten å trekke seg sammen og også for å holde belagte perler på plass under kultur. Til tross for denne støtte, er den...

Over de siste årene har den transgene mus vært den dominerende modellsystem for å studere utvikling hjertefeil. Imidlertid har andre modell organismer, slik som zebrafisk, vist seg å ha betydelige fordeler fremfor en mus. Tre store fordeler av sebrafisk er den eksterne legging av egg, for enkel tilgang til embryoene, den optiske åpenhet av embryoene, som gir enkel visualisering av hjerte utvikling, og gleden over å bruke små molekylære behandlinger for å modulere utvikling av embryo en. Dermed vil utviklingen av en dyrkningsteknikk som tillot ex utero vekst av en embryonisk organ bypass, i hvert fall delvis, er begrensningene for tiden oppleves av forskaropphald utviklingsprosesser i transgene mus. Ex vivo kardiale dyrkingssystemer har blitt utviklet i både kylling og mus embryo som tillater behandling med små molekyler og analyse av hvordan diflige områder av hjertet kommunisere 2-6. For hel mus hjerte kultur, hjertene tatt fra embryoer opp til embryonisk (E) 12.5 av alder kan plasseres i kulturmedium med eller uten vuggende 2,3,5. Ved hjelp av denne teknikken, har embryonale hjerter blitt inkubert til likeverdigheten av E13.5, og hjerter dyrket med rocking har blitt opprettholdt så lenge som tre dager (starter på E10.5) tre. Men, har ingen studier rapporterte vellykket kultur av hjerter fra eldre embryoer. Likeledes har redning eksperimenter vært begrenset til å anvende det terapeutiske midlet globalt til kulturmediet 2.. Et stykke kultur system, der hjerter er fjernet, innebygd, og seksjoneres ved hjelp av en vibratome, har også blitt brukt til både yngre hjerter, for eksempel E12.5 mus hjerter og Hamburger-Hamilton stage 36 (ca. E16 i musen) chick hjerter 2,4,6, og eldre hjerter, slik som post-natal og voksen mus hearts og voksne menneskers hjerter 7,8. Mens de embryonale analyser har typisk benyttes 150-mikrometer tykke seksjoner 2,4, kan snittetykkelsen være en stor som 500 mikrometer uten tegn på oksygenmangel åtte. Disse skive kulturer har blitt opprettholdt så lenge som to måneder i kultur, med de fleste skiver opprettholde kontraktilitet i hele denne perioden 9. Sammenlignet med studier i isolerte kardiomyocytter, disse skive kulturer tillate ko-kulturen av kardiomyocytter med de tilstøtende celletyper og gir en nyttig fremgangsmåte for ex vivo analyse. Men disse kulturer krever mer forseggjort oppsett enn ganske enkelt å plassere et hjerte i kultur medium (f.eks innebygging av levende hjerte for snitting på en vibratome), og en hvilken som helst analyse er åpenbart begrenset til den delen av hjertet innen seksjonen. Gitt de begrensninger som er beskrevet ovenfor for dyrking embryonale mus hjerter og mangfold av transgene mus available for studien, utviklet vi en ex vivo mus hjerte kultur system som ligner på en ex vivo lunge kultur system utviklet av Weaver, tillater et al. 10. Vår kultur system langsiktig kultur og visualisering av ombygging koronar sirkulasjon i hele embryonale mus hjerter. I tillegg gjør bruken av Matrigel perler til å bli holdt på plass i nærheten av hjertet, noe som gir en lokalisert behandling med terapeutiske midler. Disse eksperimenter kan utføres på forskjellige utviklingsstadier tidspunkter for å sammenligne effekten av en gitt behandling på en prosess som for eksempel koronar formasjon. Fordi små molekyler kan diffundere gjennom Matrigel, kan dette kultursystem også brukes til å kultur dissekert regioner av hjertet nær hverandre for å avgjøre om spesifikke celle-celle-kontakter som er nødvendig for visse utviklingsprosesser eller om parakrine signalering fra en region til den andre er nødvendig. Denne kulturen systemer relativt enkel og, i motsetning til skive kultur-systemet, gjør bruk av grunnleggende kultur reagenser og set-ups som er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier. I korte trekk, ble skåret ut embryonale hjerter dyrket i fortynnet Matrigel, som gir en semi-fast bærer. Denne støtten er tilstrekkelig til å opprettholde den tredimensjonale morfologi av hjertet samtidig tillater hjertet å trekke seg sammen. Ved hjelp av dette systemet, kan hele hjerter fra eldre mus embryoer (E14.5-E16.5) holdes i kultur i opptil fire dager. Hele koronar plexus opprettholdes, i motsetning til i skive kulturer, slik at eventuelle signaliserer signaler som oppstår fra ulike regioner i hjertet fortsatt til stede. Videre kan leve-celle fluorescerende fargestoffer permeat Matrigel for å tillate visualisering av levende hjerte, og protein-konjugerte perler kan plasseres i nærheten av hjertet for å gi en lokalisert kilde signalering. Sammen utgjør disse fordelene gjør denne teknikken en ideell metode for å studere utviklingsprosesser i embryonic mus hjerte.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timed-pregnant mice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS (1x)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Cellgro </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>F2442 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
 <td>BD Bioscience </td>
 <td>356231 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto-16</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>S7578 </td>
 <td>Used as directed in 13 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well culture plate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>07-200-84</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereoscopic microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ645</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture incubator</td>
 <td>Thermo </td>
 <td>3110 </td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

a novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart

Utviklingsstudier i musen er hemmet av utilgjengelighet av embryoet i løpet av svangerskapet. Således, for å isolere og protokoller kultur enkelte organer av interesse er avgjørende for å tilveiebringe en fremgangsmåte for både å visualisere endringer i utvikling og tillater nye behandlingsstrategier. Å fremme langsiktig kulturen i embryonale hjertet på sene stadier av svangerskapet, har vi utviklet en protokoll der fjernet hjerte er dyrket i en semi-solid, fortynnet Matrigel. Dette substrat gir tilstrekkelig støtte til at vedlikeholde den tredimensjonale struktur, men er fleksibel nok til å tillate fortsatt sammentrekning. I korte trekk, blir hjertene skåret ut fra embryoet og plassert i en blanding av kald Matrigel fortynnet 1:1 med vekstmedium. Etter at den fortynnede Matrigel størkner, blir vekstmedium satt til kulturen fatet. Hjerter skåret så sent som embryonale dag 16.5 var levedyktig for fire dager etter disseksjon. Analyse av koronar plexus viser at denne metoden ikkeforstyrre koronar vaskulær utvikling. Dermed presenterer vi en ny metode for langsiktig kultur av embryonale hjerter.

Ved hjelp av denne teknikken, opprettholder sitt hjerte tredimensjonale morfologi og forblir levedyktig, som indikert av fortsatt sammentrekninger (Movie 1). Disse sammentrekningene er gjennomgående mer fremtredende i atriene enn i ventriklene. Etter kultur, kan hjerter være fast og bearbeidet for histologi eller enten immunhistokjemi for å undersøke ekspresjon spesifikk markør eller strukturer. Figur 1A viser undersiden av ventriklene og store arterier av en embryonisk mus hjertet...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Utviklingsstudier i musen er hemmet av utilgjengelighet av embryoet i løpet av svangerskapet. Å fremme langsiktig kulturen i embryonale hjertet på sene stadier av svangerskapet, har vi utviklet en protokoll der fjernet hjerte er dyrket i en semi-solid, fortynnet Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metode for den embryonale mus Hjerte

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Et system for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrking av Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

En ny metode for kultur og polarisert Stimulering av menneskelige tarmslimhinnen explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mus embryoutvikling i en Serum-fri Whole Embryo Kultur System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Hud og Live-avbildning av Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Protein Isolasjon fra utviklings Embryonic Mouse hjertet ventil Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre cellen masse injeksjon av embryonale stamceller fører til høyere Chimerism priser

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...