Name: a novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Андреа Портбери за критическое прочтение рукописи и NIH (грант № R01HL061656) для финансовой поддержки.

1. Вырезанием Эмбриональные сердца <ol><li> Усыпить тайм-беременные мыши на нужной день эмбрионального развития с использованием утвержденной эвтаназии технику. Все эксперименты были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Университете Северной Каролины ?...

<ol>
	<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects.">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FGF-BMP+signaling+axis+regulates+outflow+tract+valve+primordium+formation+by+promoting+cushion+neural+crest+cell+differentiation.">The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation.</a> Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation.">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5, 62-66 (2009).</li><li>Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+contractile+characteristics+of+human+myocardium+in+multi-day+cell+culture.">Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).</li><li>Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+and+Fgf10+play+opposing+roles+during+lung+bud+morphogenesis.">Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis.</a> Development. , 127-2695 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiac Development. , (2007).</li><li>Arima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Нынешняя система культуры создает значительные преимущества для эмбриональных исследованиях сердца мыши. Эта культура система сохраняет способность миокарда и коронарный сплетение, с ограниченным признаки некроза, даже после четырех дней в культуре. Кроме того, полутвердую матрицу ...

За последние годы трансгенных мышей была преобладающей модельной системой для изучения пороки развития сердца. Тем не менее, другие организмы модели, такие как данио, оказались иметь значительные преимущества по сравнению мыши. Три основных преимущества данио являются внешними кладку яиц, для облегчения доступа к эмбрионов; оптической прозрачности эмбрионов, что позволяет легко визуализировать развития сердца и простота применения низкомолекулярных лечения, чтобы модулировать развитие эмбриона 1. Таким образом, развитие культуры метод, который позволил бывший внутриутробного роста эмбриональных орган в обход, по крайней мере частично, ограничения в настоящее время сталкиваются исследователи, изучающие процессы развития у трансгенных мышей. Экс естественных сердечной системы культуры были разработаны как в куриных эмбрионов мыши и которые позволяют обработки с малыми молекулами и анализ того, как различferent области сердца связь 2-6. Для целой культуре сердце мыши, сердца, взятых из эмбрионов до эмбриональных (E) 12,5 возраста могут быть размещены в культуральной среде с или без раскачивания 2,3,5. При использовании этого метода, эмбриональные сердца были успешно инкубировали в эквивалентности E13.5, и сердца культивировали с качалки были сохранены в течение трех дней (начиная с Е10.5) 3. Тем не менее, никаких исследований не сообщили об успешном культуру сердца из старых эмбрионов. Кроме того, спасательные эксперименты были ограничены применением терапевтического агента глобально в культуральную среду 2. Система срез культуры, в котором сердца вырезали, встроенные, и секционные использованием Vibratome, также была использована как для младших сердца, таких как мыши Е12.5 сердца и гамбургер-Гамильтона этап 36 (примерно E16 у мышей) куриного сердца 2,4,6, и старше сердца, таких как послеродовое и взрослой мыши чearts и сердца взрослого человека 7,8. В то время как эмбриональная анализы обычно используется 150-мкм срезы толщиной 2,4, толщина сечения может быть большим, чем 500 мкм без признаков кислородного голодания 8. Эти срез культуры были сохранены в течение двух месяцев в области культуры, с большинством ломтиками поддержание сократительной протяжении всего этого периода 9. По сравнению с исследований в отдельных кардиомиоцитов, эти срез культуры позволить совместного культивирования кардиомиоцитов с соседними типами клеток и обеспечивает полезный способ бывший анализ естественных условиях. Тем не менее, эти культуры требуют более сложные настройки, чем просто поместив сердце в культуральной среде (например, встраивание живого сердца для резки на Vibratome) и любой анализ, очевидно, ограничена часть сердца внутри раздела. Учитывая описанные выше ограничения для культивирования эмбриональных сердцах мыши и богатство трансгенных мышей AVAтестированию нет доступа для исследования, мы разработали бывших естественных условиях сердце мышей культуры системы, подобной бывших естественных легких культуре система, разработанная Уивер, и др.. культуры 10 Наша система позволяет долгосрочное культуры и визуализации ремоделирования коронарного кровообращения в целом эмбрионального сердца мыши. Кроме того, использование Матригель позволяет бисера, который состоится в месте недалеко от центра, обеспечивая тем самым локализованные лечения терапевтических агентов. Эти эксперименты могут быть выполнены в различных временных точках развития сравнить эффект данного лечения на процесс, такой как коронарные артерии образование. Поскольку малые молекулы могут диффундировать через Матригель, эта культура система может быть также использована для культуры расчлененный области сердца рядом друг с другом, чтобы определить, является ли конкретный межклеточных контактов необходимы для определенных процессах развития или же паракринных сигналов от одной области к другой необходимо. Эта культура системыотносительно проста и, в отличие от системы культуры ломтик, использует основные реагенты культуры и установок, которые легко доступны в большинстве лабораторий. Короче говоря, вырезали эмбрионального сердца культивируют в разбавленной Матригель, что обеспечивает полу-твердом носителе. Эта поддержка является достаточным для поддержания трехмерной морфологии сердца, а также позволяет сжатие сердца. Используя эту систему, всем сердцем из старых мышиных эмбрионов (E14.5-E16.5), может поддерживаться в культуре на срок до четырех дней. Все коронарное сплетения поддерживается, в отличие от срез культуры, поэтому любые сигналы сигнализации, которые происходят из разных регионов сердце сохранит свое присутствие. Кроме того, живых клеток флуоресцентные красители могут проникать Матригель, чтобы позволить визуализации живого сердца, и белок конъюгированные гранулы могут быть размещены вблизи сердца, чтобы обеспечить локализованный источник сигнализации. Вместе эти преимущества делают этот метод идеальным методом для изучения процессов развития эмбрионаIC сердце мыши.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timed-pregnant mice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS (1x)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Cellgro </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>F2442 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
 <td>BD Bioscience </td>
 <td>356231 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto-16</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>S7578 </td>
 <td>Used as directed in 13 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well culture plate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>07-200-84</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereoscopic microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ645</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture incubator</td>
 <td>Thermo </td>
 <td>3110 </td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

a novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart

Исследованиях развития у мышей препятствует недоступность эмбриона во время беременности. Таким образом, протоколы, чтобы изолировать и культуры отдельных органов интереса имеют важное значение в создании способа обоих визуализации изменений в развитии и позволяя стратегии нового лечения. Способствовать долгосрочных культуры эмбриональном сердце на поздних стадиях беременности, мы разработали протокол, в котором вырезали сердце культивируют в полутвердых, разбавленных Матригель. Эта подложка обеспечивает достаточную поддержку, чтобы поддерживать трехмерную структуру, но является достаточно гибкой, обеспечивая дальнейшее сокращение. Короче говоря, сердца вырезали из зародыша и помещают в смесь холодной Матригель разводили 1:1 ростовой среды. После разбавленной Матригель затвердевает, ростовой среде добавляют в чашку для культивирования. Сердца вырезали еще в эмбриональный день 16,5 были жизнеспособны в течение четырех дней после вскрытия. Анализ коронарных сплетения показывает, что этот метод ненарушить коронарных сосудов развития. Таким образом, мы представляем новый метод долгосрочного культуры эмбриональных сердцах.

При использовании этого метода, сердце сохраняет свою трехмерную морфологии и остаются жизнеспособными, как показано продолжение сокращений (фильм 1). Эти сокращения являются последовательно более заметным в предсердиях, чем в желудочках. После культуры, сердца может быть за?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Исследованиях развития у мышей препятствует недоступность эмбриона во время беременности. Способствовать долгосрочных культуры эмбриональном сердце на поздних стадиях беременности, мы разработали протокол, в котором вырезали сердце культивируют в полутвердых, разбавленных Матригель.

Роман<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Метод эмбриональном сердце мыши

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Мышиных эмбриональных легких культуры, системы оценки Молекулярные механизмы Ветвление

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Система<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культивирования эмбриональных поджелудочной железы

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Новый метод культуры и поляризованный Стимуляция кишечника человека Экспланты Слизистая

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Мышь эмбрионального развития целая культура системе эмбрионов бессывороточных

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Экс естественных Культура мышиных эмбриональных Внешний Live-визуализации меланобластов миграции

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Белок Выделение из развивающихся эмбриональных Mouse клапанов сердца регионе

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...