Name: peptide-based identification of functional motifs and their binding partners
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

كان مدعوما هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS / MBRS (جرانت 58268)، المعاهد الوطنية للصحة / NCRR / RCMI (جرانت G12-RR03034)، جورجيا بحوث التحالف التمويل في شكل منح GRA.VAC08.W، المعاهد الوطنية للصحة / NIAID / NRSA منحة F31AI091484، [إموري] CFAR منحة P30 A1050409. وقد أجريت هذا التحقيق في مركز أو قاعة للالتي شيدت مع الدعم من مرافق لبحوث التحسين جرانت # C06 RR18386 من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR. الخلايا Jurkat، فإن مجموعة من 20 فيروس نقص المناعة البشرية-1 الببتيدات نيف، فضلا عن تم الحصول على أرنب المضادة-فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف مصل ضدي من المعاهد الوطنية للصحة الإيدز بحوث &amp; برنامج الكاشف المرجعي، (روكفيل، MD).

I. استخدام الببتيدات قصير في التحليل البيولوجي I.1. رسم الزخارف وظيفية بيولوجيا باستخدام الببتيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع الببتيدات المسح نيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:r...

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

فهم الآليات الكامنة وراء قدرة نيف للتلاعب سوف مسار الاتجار exosomal تكون مفيدة في الهندسة مثبطات رواية من exNef إفراز. وينبغي أن تثبيط من exNef إفراز يقلل من CD4 نضوب T-الخليوي وكالة المخابرات المركزية الامريكية أن الآلية المرضية محرك الأقراص فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز....

مع ظهور العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، وقد تباطأ وباء الإيدز في العالم الغربي، ولكن ليس تقليصها، ويستمر انتشار فيروس نقص المناعة البشرية إلى أن تكون عبئا صحيا كبيرا في جميع أنحاء العالم. مع استثناء من فعالية هامشية RV144 التايلاندية محاكمة، وقد أظهرت حتى الآن لقاحات فيروس نقص المناعة البشرية فشل للحماية من العدوى. وهكذا، والبحث في مزيد من الأهداف، والإمكانات العلاجية لا تزال يبرره. جنبا إلى جنب مع نضوب CD4 T-الخلية، وتنشيط المناعة المعمم الثابتة هو السمة المميزة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية. هذا التنشيط المناعي المزمن (سي آي ايه) يؤدي إلى زيادة في حجم الخلية، مجموعات سكانية فرعية لمفاوي تنشيط ومتباينة، واستنفاد الخلوية والشيخوخة، وقتل الخلايا T والخلايا B عن طريق تنشيط الناتج عن موت الخلية (AICD) 1،2،3، و راسخة بأنها واحدة من أقوى المؤشرات على تطور المرض 4،5،6،7،8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء CIA وCD4تبقى خلايا T نضوب في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية إلى توضيح بشكل كامل. الأدلة من مختبرنا وغيرها أدت بنا إلى نموذج لتطور المرض (الشكل 1) حيث البروتين نيف فيروس نقص المناعة البشرية (عامل تنظيم سلبي) يحرض إفراز في exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة 13،14. هذه exosomes المحتوية نيف-(exNef) لحث على موت الخلايا المبرمج في عدد من الأنساب الخلية بما في ذلك CD4 المعافين خلايا تي 15،16. بدلا من ذلك، في حيدات / الضامة exNef يغير أنماط التعبير الجيني، على سبيل المثال التعبير خلوى، ويبدو أن إحداث حالة من التنشيط المناعي غير المجدولة. هذه الهيئة من الأدلة تشير إلى دور مهم لexNef في وكالة المخابرات المركزية ونضوب CD4 T-الخلية. فهم الآليات الكامنة وراء قدرة نيف للتلاعب سوف مسار الاتجار exosomal تكون مفيدة في الهندسة مثبطات رواية من exNef إفراز. وينبغي تثبيط إفراز exNef يقلل من استنزاف CD4 T-الخليةوكالة المخابرات المركزية أن المرضية حملة فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز. لجمع الأدلة التي أدت إلى نموذجنا لفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز تطور المرض والبيانات اللاحقة التي بنيت على هذا النموذج، ونحن وضعت عددا من الكواشف رواية والمنهجيات التي سمحت لنا لتحليل الجينات من exNef إفراز، والبدء في تحديد البروتينات الخلوية المعنية. في العمل الأولي، وجدنا أن البروتين نيف يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المارة ويتم تحريرها خارج الخلية من الخلايا نيف-transfected والمصابين بفيروس الإيدز 15. قد الببتيدات المشتقة من (الخلية اللحمية المستمدة عامل-1، مع بديل ألفا الربط) SDF-1α ثبت سابقا أن تحتفظ بالكثير من النشاط ملزمة ويشير للجزيء كامل طول 17. نحن تكهن بأن الببتيدات من نيف قد يحمل في طياته بعض النشاط أفكارك من البروتين الكامل، والتي من شأنها أن تحتوي هذه الببتيدات بالضرورة المجال أفكارك نيف (ق). لتحديد هذه الببتيدات، وبالتالي نيفمجال أفكارك (ق)، وحصل على مجموعة من 20 HIV-1 نيف الببتيدات المسح الضوئي من المعاهد الوطنية للصحة أبحاث الإيدز وبرنامج الكاشف المرجعي. هذه الببتيدات 20-AA، تتم تسمية كل متداخلة 10 الأحماض الأمينية من جارتها، من قبل عدد من مشاركة حمض أميني بهم، أي N20 يمتد نيف الأحماض الأمينية 1-20، N30 يمتد الأحماض الأمينية نيف 11-30، الخ 16. وجدنا أن تعريض خلايا تي خارج الخلية إلى الببتيدات محددة تداخل المجالات اثنين 10-AA متميزة في بروتين نيف كامل طول يسببها موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا. كشف تحليل لاحقة من هذه الببتيدات أفكارك نيف المستمدة من قدرتها على التفاعل الجسدي مع مستقبلات chemokine CXCR4 على سطح الخلايا التائية، مع حركية الملزمة التي سمحت هذه الببتيدات لمنع تنافسية ملزمة بين CXCR4 ويجند الطبيعية SDF-1α. وأخيرا، تم العثور على التفاعل الببتيدات أفكارك نيف المشتقة &#39;مع CXCR4 للحث على الاستجابة للضغط النفسي في هذه الخلايا T-مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج. هذه الأدلة سمح لنا QUICالمجالات الوظيفية KLY خريطة نيف و؛ وهي عملية قد استغرقت وقتا أطول بكثير باستخدام تقنيات الحمض النووي للطفرات قياسية مثل ألانين الطفرات المسح. كما أوضحت أيضا أن هذه الببتيدات نيف المستمدة قصيرة الاحتفاظ الوظيفة البيولوجية من المجالات أفكارك في بروتين كامل طول. وبعد تحديد دور للنيف خارج الخلية، أي موت الخلايا المبرمج للخلايا تي، سعينا إلى فهم أفضل للكيفية التي كان يفرزها نيف من الخلايا. باستخدام سلسلة من بنيات نيف تحور، ونحن تعيين حفظها للغاية الزخارف بروتين نيف في المناطق N-محطة من فيروس نقص المناعة البشرية على حد سواء نيف، ولها المكاك ريسوس يعادل SIV ماك (قردي فيروس نقص المناعة) نيف، التي تعتبر بالغة الأهمية لexNef إفراز 13. كان، انتقد بشكل خاص، كبديل ألانين من أي من الأحماض الأمينية الخمس إما تقلص إلى حد كبير أو إلغاء إفراز exNef؛ واحدة من هذه الزخارف، وإفراز تعديل المنطقة (66VGFPV70 SMR). عندما سلمت إلى الخلايا عن طريق C الحافز النشطتم العثور على بروتين hariot الكاشف التسليم، الببتيد يحتوي على SMR تعلق على تسلسل الببتيد FLAG (SMRwt) لتثبيط إفراز exNef من كلا نيف-transfected والخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 18. وبناء على تجربتنا السابقة مع الببتيدات، قررنا استخدام هذا الببتيد لإلقاء الضوء على الجزيئات والآليات الكامنة وراء دور نيف SMR في exNef إفراز. باستخدام الببتيد SMRwt كما لدينا &quot;البروتين الطعم&quot;، اشتركنا في immunoprecipitated شركاء ملزم الخلوية من SMR من المعافين لست] خلية T-18. قدمت تسلسل الببتيد FLAG مقبض مريحة لالتقاط الببتيد SMRwt باستخدام راتنج تقارب المضادة للFLAG. لدينا الحقائق السابقة أن حمض أميني أساسي واحد لألانين طفرة في الببتيد SMRwt كان كافيا لإلغاء تثبيط لها من exNef إفراز تحديد مريحة، الببتيد سيطرة محددة للغاية (SMRmut) التي استخدمناها لاستبعاد البروتينات المشترك immunoprecipitated يست محددة لSMR. باستخدام الببتيد مع لياليمجال pecific من الفائدة بدلا من بروتين كامل طول سمح لنا لتجاوز فحص العشرات من العوامل الخلوية التي تربط إلى المجالات الأخرى في نيف 19. مرة واحدة حددنا شركاء SMR ملزم، كان الخطوة المنطقية التالية لاظهار أن الشركاء ملزم الخلوية التي تم تحديدها هي مهمة لوظيفة البيولوجية 18. الإجراء العادي لتحقيق ذلك هو أن مستويات البروتين ضربة قاضية باستخدام الهدف ميرنا البروتين محددة أو سيرنا، وبعد ذلك فحص تأثير على الوظيفة البيولوجية. أجرينا ضربة قاضية ميرنا، الذي يثبط ترجمة لمرنا الهدف، والحد من إنتاج هذا الهدف، في هذه الحالة بروتين SMR ملزم. هذا التخفيض من البروتين الهدف هو أثر غير مباشر، وربما له تأثير تأخر عن وظيفة بيولوجية البروتين المستهدفة تلعب دورا فيها وبناء على ذلك، قمنا بتوظيف أيضا أقل شيوعا الضد تقنية تثبيط لتحديد ما إذا تعطيل مباشرة النشاط منالبروتين الهدف يقلل أو يلغي الوظيفة البيولوجية. في هذا الإجراء، رفع أجسام مضادة ضد بروتين المستهدفة و transfected في الخلية باستخدام عربة الكاشف، والتفاعل بشكل مباشر مع البروتين الهدف إما أنه عزل من موقعه من وظيفة، أو عرقلة المجال الخاص به الملزمة ذات الصلة. تثبيط البروتين الهدف من خلال هذا الإجراء يعطل مباشرة وظيفتها، ويمكن أن تكمل إجراءات ضربة قاضية RNA عن طريق زيادة التأكيد على أهمية البروتين الهدف إلى الوظيفة البيولوجية. بينما عربة الكاشف فعال في تقديم الببتيدات والبروتينات في الخلايا، وهذا هو عملية تستغرق وقتا طويلا ويحد من أنواع التجارب، على سبيل المثال التعرض لفترات طويلة أو متكررة والدراسات على الحيوانات في الجسم الحي التي يمكن القيام بها. ونتيجة لذلك، واضاف نحن الببتيد (CPP) تسلسل لاختراق الخلية إلى SMRwt الببتيد (SMRwt-CPP) 18 لإنشاء الببتيد التي يمكن اتخاذها من قبل الخلايا بشكل سلبيمن وسائل الإعلام الثقافة. وكان هذا الإصدار فعالة مثل السابق في إفراز exNef معرقلة. الأدلة من هذه التجارب نشرت يدل على قدرة الببتيدات الصغيرة التي تحتوي على زخارف وظيفية محددة لاستعداء ظيفة البروتين كامل طول عن طريق تثبيط تنافسية، وعزل البروتينات التي تربط هذه الزخارف. ويتوقع المرء أن هذه التقنيات ينبغي أن تكون مفيدة في كثير من البروتوكولات التجريبية. وينبغي أيضا أن تكون فعالة في الهندسة رواية مثبطات الببتيد العديد من العمليات الخلوية؛ دالة التي يمكن تعزيزه من خلال الربط إلى متواليات CPP.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

الببتيدات قصيرة محددة مستمدة من الزخارف الموجودة في البروتينات كامل طول، في حالتنا HIV-1 نيف، في الحفاظ ليس فقط وظيفة بيولوجية، ولكن يمكن أيضا أن تمنع بشكل تنافسي وظيفة البروتين كامل طول. واستخدمت مجموعة من 20 نيف الببتيدات المسح، 20 الأحماض الأمينية في الطول مع كل متداخلة 10 الأحماض الأمينية من جارتها، لتحديد العناصر الزخرفية في نيف المسؤولة عن تحريض له من موت الخلايا المبرمج. الببتيدات التي تحتوي على هذه العناصر الزخرفية التي يسببها موت الخلايا المبرمج أفكارك عند مستويات مماثلة لبروتين نيف كامل طول. A الببتيد الثانية، والمستمدة من إفراز تعديل المنطقة (SMR) من نيف، والإبقاء على القدرة على التفاعل مع البروتينات الخلوية تشارك في إفراز نيف في exosomes (exNef). وقد استخدم هذا الببتيد SMRwt باسم &quot;الطعم&quot; البروتين في التجارب المشتركة مناعي لعزل البروتينات الخلوية التي تربط خصيصا لعزر SMR نيف و. تم استخدام البروتين ترنسفكأيشن والأجسام المضادة تثبيط لتعطيل جسديا الرهان التفاعلوقد تم قياس وين نيف وmortalin، واحد من البروتينات SMR ملزم المعزولة، وتأثير مع القائم الفلورسنت exNef فحص إفراز. قدرة الببتيد SMRwt لتكومبيتي نيف كامل طول لالبروتينات الخلوية التي تربط بين عزر SMR، وجعلها المانع الأول من exNef إفراز. وهكذا، من خلال توظيف التقنيات الموضحة هنا، والتي تستفيد من خصائص فريدة من نوعها من الببتيدات قصيرة محددة مستمدة من الزخارف الموجودة في البروتينات كامل طول، يمكن للمرء أن الإسراع في تحديد الدوافع الوظيفية في البروتينات وتطوير مثبطات القائم على الببتيد من الوظائف المسببة للأمراض.

رسم الخرائط الدوافعع وظيفي بيولوجيا باستخدام هضميدات. وقد تم تحديد اثنين من المناطق بشأن البروتينات نيف التي تحفز على موت الخلايا المبرمج. وقد لوحظ موت الخلايا المبرمج-يحركها الببتيد (الشكل 2) بداية مع الببتيد N50 (AA30-50)، وتبلغ ذروتها في N60 (aa40-60) وN70 (aa50...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

تم وصفها تقنيات لتشريح الآليات الكامنة وراء من إفراز من فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف في exosomes. تم استغلال الببتيدات قصيرة محددة المستمدة من NEF وترنسفكأيشن البروتين لتحديد هيكل، وظيفة، والشركاء ملزم من نيف للسفر إفراز تعديل المنطقة. هذه الإجراءات ديك صلة عامة بالموضوع في العديد من الدراسات الآلتي.

تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

التالية في الوقت الحقيقي تأثير العوامل الالتهاب الرئوي الحاد الفوعة في نموذج الفأر الالتهاب الرئوي عن طريق البكتيريا للإضاءة الحيوية

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

عزل وتحديد الخلايا المناعية اكسترافاسكولار للقلب

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...