Name: peptide-based identification of functional motifs and their binding partners
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansiering tilskud GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA tilskud F31AI091484, Emory CFAR tilskud P30 A1050409. Denne undersøgelse blev gennemført i et anlæg bygget med støtte fra Research Facilities Improvement Grant # C06 RR18386 fra NIH / NCRR. Jurkat-celler, det sæt af 20 HIV-1-Nef-peptider, såvel som kanin-anti-HIV-1 Nef antiserum blev opnået fra NIH AIDS Research &amp; referencereagens Program (Rockville, MD).

I. Anvendelse af korte peptider i Biologisk Analysis I.1. Kortlægning Biologisk Funktionelle Motiver Brug peptider <ol><li> Behandling celler med Nef scanning peptider <ol><li> Skaffe en række af peptider scanning området af interesse. For vores eksperimenter, 20mer peptider, med 10 aminosyrer overlap, spænder over hele HIV-1 Nef-protein (205 aa), blev opnået fra AIDS Reagent Program. Peptiderne analyseres individuelt som følger: </li><li> Tilsæt 10 ng / ml af peptidet til cellekulturm...

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

Forstå de mekanismer, der ligger til grund Nef evne til at manipulere exosomal trafficking vej vil være nyttige i tekniske hidtil ukendte inhibitorer af exNef sekretion. Hæmning af exNef sekretion bør mindske CD4 T-celle depletion og CIA at drive HIV / AIDS patogenese. Til dette mål, har vi udviklet en række nye reagenser og metoder, tilladt os at analysere genetik exNef sekretion, og begynde at bestemme de cellulære involverede proteiner. Denne fremgangsmåde førte også til udviklingen af ​​den første inh...

Med fremkomsten af ​​anti-retroviral behandling er aids-epidemien i den vestlige verden er blevet bremset, men ikke indskrænket, og udbredelsen af ​​hiv fortsætter med at være et stort sundhedsmæssigt belastning i hele verden. Med undtagelse af den marginalt effektive RV144 Thai retssag, har HIV-vacciner hidtil vist manglende beskyttelse mod infektion. Således er forskning i yderligere potentielle terapeutiske mål stadig berettiget. Sammen med CD4 T-celle depletion, er vedvarende generaliseret immunaktivering kendetegnende for HIV-infektion. Denne Kronisk immunaktivering (CIA), fører til stigninger i celle omsætning, aktiverede og differentieret lymfatisk delpopulationer, cellulære udmattelse og ældning, og drabene på T-celler og B-celler via aktivering celledød (AICD) 1,2,3, og det er godt etableret som en af de stærkeste prædiktorer for sygdomsprogression 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Men mekanismerne bag CIA og CD4T-celle depletion ved HIV-infektion er endnu ikke fuldt belyst. Evidens fra vores laboratorium, og andre førte os til en model for sygdomsprogression (figur 1), hvor HIV-proteinet Nef (Negativ Regulatory Factor) inducerer sin sekretion i exosomes fra HIV-1 inficerede celler 13,14. Disse Nef-holdige exosomer (exNef) inducere apoptose i en række cellelinier, herunder inficerede CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocytter / makrofager exNef ændrer genekspression mønstre, f.eks cytokinekspression, og synes at inducere en tilstand af uplanlagt immunaktivering. Dette organ bevis antyder en vigtig rolle for exNef i CIA og CD4 T-celle depletion. Forstå de mekanismer, der ligger til grund Nef evne til at manipulere exosomal trafficking vej vil være nyttige i tekniske hidtil ukendte inhibitorer af exNef sekretion. Inhibering af exNef sekretion vil aftage CD4 T-celle depletionog CIA at drive HIV / AIDS patogenese. At samle de beviser, der førte til vores model for HIV / AIDS sygdomsprogression og de efterfølgende data, bygget på denne model, har vi udviklet en række nye reagenser og metoder, tilladt os at analysere genetik exNef sekretion, og begynde at bestemme cellulære proteiner involveret. I det indledende arbejde, fandt vi, at Nef-protein inducerer apoptose i bystander celler og frigives ekstracellulært fra Nef-transficerede og HIV-inficerede celler 15. Peptider afledt af SDF-1α (stromacelle Derived Factor-1, med alternativ splejsning alfa) tidligere er blevet vist at bevare meget af den bindende og signalering aktivitet molekyle i fuld længde 17. Vi spekuleret på, at peptider af Nef kunne bevare nogle af den apoptotiske aktivitet af den fulde protein-, og at disse peptider ville nødvendigvis indeholde Nef apoptotiske domæne (r). At identificere disse peptider, og dermed Nefapoptotic domæne (r), opnåede vi et sæt af 20 HIV-1-Nef scanning peptider fra NIH AIDS forskning og referencereagenten Program. Disse 20-aa peptider er hver overlappende 10 aminosyrer af sin nabo, navngivet af antallet af deres sidste aminosyre, dvs N20 spænder Nef aminosyrerne 1-20, N30 spænder Nef aminosyrer 11-30, osv. 16.. Vi fandt at udsætte T-celler ekstracellulært til specifikke peptider overlappende to forskellige 10-aa domæner i fuld længde Nef-protein induceret apoptose i disse celler. Efterfølgende analyse af disse Nef-afledte apoptotiske peptider viste deres evne til fysisk at interagere med chemokinreceptor CXCR4 på overfladen af ​​T-celler, med bindingskinetik der tillod disse peptider til kompetitivt at inhibere binding mellem CXCR4 og dens naturlige ligand SDF-1α. Endelig blev de Nef-afledte apoptotiske peptider interaktion med CXCR4 sig at inducere en stress-respons i disse T-celler, hvilket fører til apoptose. Dette beviser tilladt os at quicKLY map Nef funktionelle domæner, en proces, der ville have taget meget længere tid ved hjælp af standard DNA mutagene teknikker såsom alaninscanningsmutagenese. Det viste også, at disse korte Nef-afledte peptider bibeholdt den biologiske funktion af de apoptotiske domæner i fuld-længde proteinet. Efter at have identificeret en rolle for ekstracellulær Nef, dvs apoptose af T-celler, søgte vi en bedre forståelse af, hvordan Nef blev udskilt fra cellerne. Anvendelse af en serie af muterede Nef konstruktioner kortlagde vi stærkt konserverede Nef proteinmotiver i de N-terminale regioner af både HIV Nef, og dens Rhesus macaque tilsvarende SIV mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, der er kritiske for exNef sekretion 13. En af disse motiver, sekretion Ændring Region (SMR, 66VGFPV70), var særligt kritisk, da alanin udskiftning af nogen af ​​sine fem aminosyrer enten stærkt reduceret eller afskaffet exNef sekretion. Ved levering til celler via Active Motif s Chariot Protein Delivery Reagent, et peptid indeholdende SMR fastgjort til en FLAG peptidsekvens (SMRwt) blev fundet at inhibere exNef sekretion fra både Nef-transficerede og HIV-inficerede celler 18. Baseret på vores tidligere erfaringer med peptider, besluttede vi at bruge dette peptid at belyse molekyler og mekanismerne bag det Nef SMR rolle i exNef sekretion. Brug af SMRwt peptid som vores &quot;bait protein&quot;, vi co-immunofældet cellulære bindende partnere i SMR fra inficerede T-cellelysater 18. FLAG-peptidsekvensen billede en praktisk håndtag til at opfange SMRwt peptid under anvendelse af anti-FLAG affinitetsharpiks. Vores tidligere fund, at en enkelt valin til alanin mutation i SMRwt peptid var tilstrækkelige til at afvikle sin hæmning af exNef sekretion identificeret en bekvem, meget særlige kontrol peptid (SMRmut), som vi brugte til at udelukke co-immunopræcipiterede proteiner ikke specifikke for SMR. Ved hjælp af et peptid med sPECIFIKKE domæne af interesse snarere end fuld-længde proteinet tilladt os at omgå screening af dusinvis af cellulære faktorer, der binder til andre domæner i Nef 19.. Når vi identificeret de SMR-bindende partnere et logisk næste skridt var at vise, at de identificerede cellulære bindende partnere er vigtige for den biologiske funktion 18.. Den normale procedure at opnå dette er at Knockdown protein niveauer ved hjælp målprotein-specifik miRNA eller siRNA, og efterfølgende assay effekt på den biologiske funktion. Vi udførte miRNA knockdown, som hæmmer translation af mål-mRNA&#39;et, hvilket reducerer produktionen af ​​dette mål, i dette tilfælde en SMR-bindende protein. Denne reduktion af målproteinet er en indirekte effekt, og muligvis har en forsinket virkning på den biologiske funktion den tilsigtede protein spiller en rolle i. Derfor har vi også ansat den mindre almindelige antistof hæmning teknik at afgøre, om direkte forstyrre aktiviteten afmålproteinet reducerer eller eliminerer den biologiske funktion. I denne procedure, rejst antistoffer mod målrettet proteinet, transficeres ind i cellen ved hjælp Chariot reagens, og interagere direkte med målproteinet enten sekvestrerende det fra sin hjemmeside af funktion, eller blokere dens relevante bindende domæne. Inhibering af målproteinet gennem denne procedure direkte forstyrrer dens funktion, og kan supplere RNA knockdown procedurer ved yderligere bekræfter betydningen af ​​målproteinet til den biologiske funktion. Mens Chariot Reagent er effektivt til at levere peptider og proteiner i celler denne proces er tidskrævende og begrænser de typer af eksperimenter, fx langvarig eller gentagen eksponering og in vivo dyreforsøg, der kan udføres. Derfor har vi tilføjet en celle-gennemtrængende peptid (CPP) sekvens med SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 at generere et peptid, der kunne optages af celler passivtfra kulturmedier. Denne version var lige så effektivt som den førstnævnte inhibering exNef sekretion. Dataene fra disse publicerede eksperimenter viser evnen hos små peptider indeholdende specifikke funktionelle motiver til at antagonisere funktionen af ​​fuldlængde proteinet gennem kompetitiv inhibering, og at isolere de proteiner, der binder disse motiver. Man ville forvente, at disse teknikker bør være nyttige i mange forsøgsprotokoller. De bør også være effektiv i engineering nye peptidbaserede inhibitorer af mange cellulære processer, en funktion, der kan blive yderligere forstærket af kobling til CPP sekvenser.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, i vores tilfælde HIV-1 Nef, ikke blot bevarer deres biologiske funktion, men kan også kompetitivt at inhibere funktionen af ​​fuldlængde-proteinet. Et sæt af 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyrer i længde med hver overlappende 10 aminosyrer af dets nabo, blev brugt til at identificere motiver i Nef ansvarlig for induktion af apoptose. Peptider indeholdende disse apoptotiske motiver apoptose på niveauer svarende til den fulde længde Nef-protein. En andet peptid, der stammer fra Sekretion Ændring region (SMR) i Nef bevaret evnen til at interagere med cellulære proteiner involveret i Nef s sekretion i exosomer (exNef). Denne SMRwt peptid blev anvendt som &quot;lokkemad&quot; protein i co-immunopræcipitation eksperimenter at isolere cellulære proteiner, der binder specifikt til Nef s SMR motiv. Protein transfektion og antistof hæmning blev anvendt til fysisk at forstyrre vekselvirkningen betlem Nef og Mortalin, en af ​​de isolerede SMR-bindende proteiner, og virkningen blev målt med et fluorescerende-baserede exNef sekretion assay. Den SMRwt peptid evne til at udkonkurrere fuld længde Nef for cellulære proteiner, som binder SMR motiv, gør det til det første hæmmer af exNef sekretion. Således, ved anvendelse af teknikkerne beskrevet her, der udnytter de unikke egenskaber af specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, kan man accelerere identifikation af funktionelle motiver i proteiner og udvikling af peptid-baserede inhibitorer af patogene funktioner.

Kortlægning Biologisk Funktionelle Motiver hjælp peptider. To regioner blev identificeret på Nef proteiner, der inducerer apoptose. Peptid-drevet apoptose blev observeret (figur 2), der begynder med peptid N50 (AA30-50) og toppede på N60 (aa40-60) og N70 (aa50-70), og aftagende til baggrundsniveau på peptid N100 (aa80-100). Den største Motif 1 (M1) top, centreret om aa50-60, inducerer&gt; 80% af de apoptotiske niveauer i fuld længde Nef-protein. En anden, mindre apoptotisk top bl...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Teknikker til at dissekere mekanismerne bag udskillelsen af ​​HIV-1 Nef i exosomes beskrevet. Specifikke korte peptider afledt fra Nef og protein transfektion blev udnyttet til at bestemme strukturen, funktionen og bindingspartnere af Nef s Sekretion Ændring Region. Disse procedurer har generel relevans i mange mekanistiske undersøgelser.

Peptid-baserede identifikation af funktionskravene motiver og deres bindingspartnere

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i Real Time konsekvenserne af Pneumokok virulensfaktorer i en akut Mouse Lungebetændelse Model Brug Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging af myeloide celler dynamik i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumorer ved Spinning Disk Konfokal mikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Opklaringen af ​​funktion en Bakteriel Effector fra et ikke-dyrkbare Plant patogener Ved hjælp af en Gær To hybrid skærm

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering af bughinden-afledte mastceller og deres funktionelle karakterisering med Ca2 +-billedbehandling og degranulering Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikation af virulens markører af Mycobacterium abscessus intracellulære replikering i fagocytter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolering og identifikation af ekstravaskulære immunceller af hjertet

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...