Name: peptide-based identification of functional motifs and their binding partners
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58.268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgië Research Alliance financiering subsidie ​​GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA subsidie ​​F31AI091484, Emory CFAR subsidie ​​P30 A1050409. Dit onderzoek werd uitgevoerd in een faciliteit gebouwd met steun van Research Facilities Verbetering Grant # C06 RR18386 van NIH / NCRR. De Jurkat-cellen, de set van 20 HIV-1 Nef peptiden, evenals het konijn anti-HIV-1 Nef antiserum werden verkregen van het NIH AIDS Research en Reference Reagent Program, (Rockville, MD).

I. Het gebruik van korte peptiden in Biological Analysis I.1. Mapping Biologisch Functionele Motieven gebruiken Peptiden <ol><li> Behandelen cellen met Nef scanning peptiden <ol><li> Schaffen een set van peptiden scannen het gebied van belang. Voor onze experimenten 20-meer peptiden met 10 aminozuren overlappen, die de gehele HIV-1 Nef-eiwit (205 aa), werden verkregen van de AIDS Reagent Program. De peptiden zijn afzonderlijk als volgt bepaald: </li><li> Voeg 10 ng / ml peptide aan het celkwe...

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef&#39;s te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie moet de CD4 T-cel depletie en CIA die rijden HIV / AIDS pathogenese afnemen. Naar dit doel, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie te analyseren, en beginnen om de cellulaire eiwitten die betrokken bepalen ontwikkeld. Deze benadering heeft o...

Met de komst van de anti-retrovirale therapie, is de aids-epidemie in de westerse wereld is vertraagd, maar niet beperkt, en de verspreiding van HIV blijft een belangrijk gezondheidsprobleem last over de hele wereld. Met uitzondering van de weinig effectieve RV144 Thai onderzoek kregen HIV vaccins tot dusver geen bescherming tegen infectie. Zo is het onderzoek naar aanvullende, potentiële therapeutische doelen nog steeds gerechtvaardigd. Naast CD4 T-cel depletie, persistente gegeneraliseerde immune activering is een kenmerk van HIV-infectie. Dit Chronische Immune Activering (CIA) leidt tot een verhoogde celvernieuwing, geactiveerd en gedifferentieerd lymfatische subpopulaties, cellulaire uitputting en veroudering, en het doden van T-cellen en B-cellen via Activering-geïnduceerde celdood (AICD) 1,2,3, en het is goed gevestigd als een van de sterkste voorspellers van progressie van de ziekte 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Echter, de onderliggende mechanismen CIA en CD4T-celdepletie in HIV-infecties niet volledig opgehelderd. Bewijs uit ons lab en anderen leidde ons naar een model voor de progressie van de ziekte (figuur 1) waarin de HIV-eiwit Nef (Negative Regulatory Factor) induceert de afscheiding in exosomes van HIV-1 geïnfecteerde cellen 13,14. Deze Nef-bevattende exosomes (exNef) induceren apoptose in een aantal cellijnen waaronder geïnfecteerde CD4 T-cellen 15,16. Als alternatief, in monocyten / macrofagen exNef verandert genexpressie patronen, bijv. cytokine-expressie, en lijkt een toestand van ongepland activering van het immuunsysteem veroorzaken. Deze hoeveelheid bewijs suggereert een belangrijke rol voor exNef in CIA en CD4 T-cel depletie. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef&#39;s te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie de CD4 T-cel depletie verminderenen de CIA dat station HIV / AIDS pathogenese. Om het bewijs dat leidde tot ons model voor HIV / AIDS progressie van de ziekte en de daaropvolgende data die bouwde op dit model te verzamelen, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie analyseren ontwikkeld, en beginnen aan het bepalen cellulaire proteïnen betrokken. In het eerste werk, we vonden dat Nef proteïne induceert apoptose in cellen omstanders en extracellulair vrij van Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen 15. Peptiden afgeleid van SDF-1α (stromale cel afgeleide factor-1, met alternatieve splicing alpha) was eerder aangetoond dat veel van de binding en signalerende activiteit van het volledige-lengte molecule 17 behouden. We speculeerden dat peptiden Nef enkele van de apoptotische activiteit van het volledige eiwit en dat deze peptiden zouden nood Nef apoptotische domein (en) bevatten kunnen behouden. Om deze peptiden te identificeren en dus de Nefapoptotische domein (en), verkregen we een set van 20 HIV-1 Nef scannen peptiden van de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Deze 20-aa peptiden, elk overlappend 10 aminozuren van zijn buur, worden genoemd door het aantal van hun laatste aminozuur, dwz N20 overspanningen Nef aminozuren 1-20, N30 overspanningen Nef aminozuren 11-30, etc 16. We vonden dat het blootstellen van T-cellen extracellulair specifieke peptiden overlappen twee afzonderlijke 10-aa domeinen in de full-length Nef proteïne geïnduceerde apoptose in deze cellen. Daaropvolgende analyse van deze Nef-apoptotische afgeleide peptiden bleek hun vermogen om fysiek interactie met de chemokine receptor CXCR4 op het oppervlak van T-cellen, met bindingskinetiek die mogen deze peptiden om competitief binding te remmen tussen CXCR4 en natuurlijke ligand SDF-1α. Tenslotte, de Nef-afgeleide apoptotische peptiden interactie CXCR4 bleek een stressrespons in deze T-cellen leidt tot apoptose. Dit bewijsmateriaal liet ons toe om quicfunctionele domeinen kly kaart Nef&#39;s, een proces dat veel langer zou hebben genomen met behulp van standaard DNA-mutagene technieken zoals alaninescanningsmutagenese. Het toonde ook aan dat deze korte Nef-peptiden behouden de biologische functie van de apoptotische domeinen in het eiwit van volledige lengte. Na een rol voor extracellulair Nef geïdentificeerd, dwz apoptose van T-cellen, zochten we een beter begrip van hoe Nef werd afgescheiden uit cellen. Met een reeks gemuteerde Nef constructen toonden we zeer geconserveerde motieven Nef eiwit in de N-terminale gebieden van zowel HIV Nef en de Rhesus macaque equivalente mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die essentieel zijn voor exNef afscheiding 13. Een van deze motieven, de Afscheiding Modification Gewest (SMR; 66VGFPV70), was bijzonder kritisch, zoals alanine vervanging van een van haar vijf aminozuren ofwel sterk verminderd of afgeschaft exNef secretie. Bij aflevering aan cellen via Active Motif&#39;s CHariot Protein Delivery Reagent, een peptide dat de SMR aan een FLAG-peptide sequentie (SMRwt) bleek exNef secretie remmen van zowel Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen 18. Op basis van onze eerdere ervaringen met peptiden, hebben we besloten om dit peptide te gebruiken om de moleculen en mechanismen die ten grondslag liggen aan de rol van de Nef SMR&#39;s in exNef secretie verhelderen. Met behulp van de SMRwt peptide als onze &quot;lokaas eiwit&quot;, we co-immunogeprecipiteerd cellulaire binding partners van de SMR uit niet-geïnfecteerde T-cellysaten 18. De FLAG-peptide sequentie voorzien van een handig handvat voor het vastleggen van de SMRwt peptide met behulp van anti-FLAG affiniteitshars. Onze eerdere bevinding dat een enkele valine naar alanine mutatie in het SMRwt peptide was voldoende voor de afschaffing van de remming van exNef secretie identificeerde een handige, zeer specifieke controle peptide (SMRmut) die we gebruikten om uit te sluiten co-geïmmunoprecipiteerde eiwitten niet specifiek voor de SMR. Gebruik van een peptide met de specifiek domein plaats dan de full-length eiwit konden we de screening van tientallen cellulaire factoren die binden aan andere domeinen Nef 19 omzeilen. Eens we de SMR-bindende partners, een logische stap was aan te tonen dat de geïdentificeerde cellulaire bindende partners zijn belangrijk voor de biologische functie 18. De standaardprocedure om dit te bereiken is het knockdown eiwitniveaus met doeleiwit-specifieke miRNA en siRNA en vervolgens assay het effect op de biologische functie. We voerden miRNA knockdown, die translatie van het doelwit-mRNA remt waardoor productie van dit doel, in dit geval een SMR-bindend eiwit. Deze vermindering van het doeleiwit is een indirect effect, en heeft eventueel een vertraagd effect op de biologische functie het doelgericht eiwit speelt een rol in Daarom hebben we ook de minder voorkomende antilichaam remming techniek gebruikt om te bepalen of direct verstoren van de activiteit vanhet doeleiwit beperkte of geen biologische functie. In deze werkwijze worden antilichamen opgewekt tegen het doelwit eiwit getransfecteerd in de cel met behulp Chariot Reagent en rechtstreeks met het doeleiwit of afzonderen uit de plaats van de functie, of de relevante bindende domein blokkeren. Remming van het doelwit eiwit via deze procedure rechtstreeks verstoort zijn functie, en kan RNA knockdown procedures aan te vullen met verdere bevestiging van het belang van het doelwit eiwit naar de biologische functie. Terwijl Chariot Reagens effectief in het leveren van peptiden en eiwitten in cellen, een proces is tijdrovend en beperkt de aard van de dierproeven, bijvoorbeeld langdurige of herhaalde blootstelling en in vivo dierstudies die kunnen worden uitgevoerd. Daarom hebben we een cel-penetrerende peptide (CPP) die toegevoegd is aan de SMRwt peptide (SMRwt-CPP) 18 een peptide die kunnen worden overgenomen door cellen passief producerenuit het kweekmedium. Deze versie was even werkzaam als de eerste bij het remmen exNef secretie. Het bewijs uit de gepubliceerde experimenten toont het vermogen van kleine peptiden die specifieke functionele motieven voor de functie van het eiwit van volledige lengte antagoniseren door competitieve remming, en de eiwitten die deze motieven binden te isoleren. Men zou verwachten dat deze technieken moet nuttig in vele experimentele protocollen. Zij moeten ook effectief in engineering nieuwe peptide remmers van vele cellulaire processen, een functie die kan verder worden verbeterd door binding aan CPP sequenties.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten, in dit geval HIV-1 Nef, niet alleen hun biologische functie behouden, maar ook concurrerend de functie van het eiwit van volledige lengte remmen. Een set van 20 Nef scanning peptides, 20 aminozuren lang met elkaar overlappende 10 aminozuren van zijn buur, werden gebruikt om motieven in Nef verantwoordelijk voor de inductie van apoptose te identificeren. Peptiden die deze apoptotische motieven apoptose vergelijkbaar niveau van volledige lengte Nef proteïne. Een tweede peptide, afgeleid van de Afscheiding Modification Gewest (SMR) van Nef, behield de mogelijkheid tot interactie met cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij Nef&#39;s secretie in exosomes (exNef). Deze SMRwt peptide werd gebruikt als &quot;lokaas&quot; eiwit in co-immunoprecipitatie experimenten cellulaire eiwitten die specifiek binden aan de Nef SMR motief isoleren. Eiwit en antilichaam transfectie remming gebruikt wordt om de interactie verstoren inzetween Nef en mortalin, een van de geïsoleerde SMR-bindende proteïnen, en het effect werd gemeten met een fluorescentie-gebaseerde exNef secretie assay. Het vermogen van de SMRwt peptide om full-length Nef outcompete voor cellulaire eiwitten die de SMR motief binden, maken het de eerste remmer van exNef secretie. Aldus door het gebruik van hier beschreven technieken, die de unieke eigenschappen van specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten gebruiken, kan men de identificatie van functionele motieven in eiwitten en de ontwikkeling van peptide-gebaseerde remmers van pathogene functies versnellen.

Mapping Biologisch Functionele Motieven behulp Peptiden. Twee regio&#39;s werden geïdentificeerd op Nef eiwitten die apoptose te induceren. Peptide-driven apoptose werd waargenomen (Figuur 2) begin met peptide N50 (aa30-50), met een piek op N60 (AA40-60) en de N70 (aa50-70), en afnemende tot achtergrondniveau op peptide N100 (aa80-100). De belangrijkste Motief 1 (M1) piek gecentreerd op aa50-60 induceert&gt; 80% van de apoptotische niveaus van de volledige lengte Nef proteïne. Een twe...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Technieken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding van HIV-1 Nef in exosomes ontleden worden beschreven. Specifieke korte peptiden afgeleid van Nef en eiwit transfectie werden uitgebuit om de structuur, functie, en bindende partners van Nef&#39;s Secretion Wijziging Region bepalen. Deze procedures hebben algemene belang in veel mechanistische studies.

Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Particle Agglutinatie Methode voor Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...