Name: peptide-based identification of functional motifs and their binding partners
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Forskning Alliance finansiering stipend GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA stipend F31AI091484, Emory CFAR stipend P30 A1050409. Denne undersøkelsen ble gjennomført i et anlegg bygget med støtte fra Research anlegg forbedring Grant # C06 RR18386 fra NIH / NCRR. De Jurkat-celler, settet av 20 HIV-1 Nef peptider, samt kanin-anti-HIV-1 Nef-antiserum ble oppnådd fra NIH AIDS Research &amp; Reference Reagent Program, (Rockville, MD).

I. Bruk av Short Peptider i Biological Analysis I.1. Fargetilordning Biologisk Funksjonelle Motifs Bruke Peptides <ol><li> Treating celler med Nef skannebehov peptider <ol><li> Fremskaffe et sett av peptider skanning regionen av interesse. For våre eksperimenter, -20 mer peptider, med ti aminosyre overlapping, som spenner over den hele HIV-1 Nef protein (205 aa), ble innhentet fra den AIDS Reagent Program. De peptider er assayed individuelt som følger: </li><li> Tilsett 10 ng / ml av peptid...

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

Forstå de mekanismene bak Nef evne til å manipulere den exosomal trafficking pathway vil være nyttig seg på engineering romanen hemmere av exNef sekresjon. Hemming av exNef sekresjon bør redusere CD4 T-celle uttømming og CIA som driver HIV / AIDS patogenesen. Mot dette målet, har vi utviklet en rekke nye reagenser og metoder som tillater oss å analysere genetikk av exNef sekresjon, og begynne å bestemme cellulære proteiner involvert. Denne tilnærmingen førte også til utviklingen av den første inhibitor til...

Med den advent av anti-retroviral terapi, har den AIDS epidemien i den vestlige verden blitt bremset, men ikke curtailed, og spredningen av HIV fortsetter å være en stor helse byrde over hele verden. Med unntak av den marginalt effektive RV144 Thai rettssaken, har HIV-vaksiner så langt vist unnlatelse av å beskytte fra infeksjon. Således, er forskning inn i ytterligere, potensielle terapeutiske mål fortsatt hjemlet. Sammen med CD4 T-celle uttømming, er persistent generalisert immune aktivering et kjennetegn på HIV infeksjon. Denne Kronisk Immune Activation (CIA) fører til øker i celle omsetning, påslåtte og differensiert lymfocytiske subpopulasjoner, cellular utmattelse og senescence, og drapet av T-celler og B-celler via Activation-Induced Cell Death (AICD) 1,2,3, og det er godt etablert som en av de sterkeste prediktorer av sykdom progresjon 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Imidlertid, de mekanismene som ligger til grunn CIA og CD4T-celle uttømming hos HIV-infeksjon er fortsatt ikke helt klarlagt. Bevis fra vår lab og andre førte oss til et modell for sykdom progresjon (Figur 1) hvori den HIV protein Nef (Negativ Regulatory Factor) induserer sin sekresjon i exosomes fra HIV-ett infiserte celler 13,14. Disse Nef-holdige exosomes (exNef) indusere apoptose i et antall av celle slektsnavn inkludert uninfected CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocytter / makrofager exNef endrer gene expression mønstre, f.eks cytokin uttrykk, og ser ut til å indusere en tilstand av unscheduled immune aktivering. Denne kropp av bevis tyder på en viktig rolle for exNef i CIA og CD4 T-celle uttømming. Forstå de mekanismene bak Nef evne til å manipulere den exosomal trafficking pathway vil være nyttig seg på engineering romanen hemmere av exNef sekresjon. Hemming av exNef sekresjon bør minske den CD4 T-celle uttømmingog CIA at stasjonen HIV / AIDS patogenesen. Å samle bevisene som førte til våre modell for HIV / AIDS sykdom progresjon og de påfølgende data som bygde bort på denne modellen, utviklet vi en rekke av romanen reagenser og metodologier som mulig for oss til å analysere de genetikk av exNef sekresjon, og begynne å bestemme den cellulære proteiner involvert. I det innledende arbeidet, fant vi at Nef protein induserer apoptose i tilskuer celler og er utgitt ekstracellulært fra Nef-transfekterte og HIV-infiserte celler 15. Peptider avledet fra SDF-1α (Stromale celle Avledet Factor-1, med alternativ spleising alfa) hadde blitt tidligere er vist å beholde mye av den bindende og signalnettverk aktivitet av den full-lengde molekyl 17.. Vi spekulert i at peptidene fremstilt Nef kanskje vil beholde noen av den apoptose aktivitet av den fulle protein, og at disse peptidene nødvendigvis ville inneholde den Nef-apoptotisk domene (e). Å identifisere disse peptider, og følgelig den Nefapoptotisk domene (s), innhentet vi et sett av 20 HIV-en Nef skanning peptider fra den NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Disse tjue-aa peptider, er hver overlappende 10 aminosyrer av nabo sin, oppkalt med antall av deres siste amino syre, N20 dvs. spenn Nef aminosyrer 1-20, N30 spenn Nef aminosyrer 11-30, 16 etc. Vi fant ut at å utsette t-celler ekstracellulært til spesifikke peptider overlappende to distinkte 10-AA domener i den full-lengde Nef-protein som indusert apoptose i disse cellene. Oppfølgende analyse av disse Nef-deriverte apoptotic peptider avslørt deres evne til å fysisk samhandle med den chemokine reseptoren påvist CXCR4 på overflaten av t-celler, med bindende kinetikk som tillot disse peptidene for å kompetitivt inhibere binding mellom kl CXCR4 og dens naturlige ligand SDF-1α. Til slutt, ble de Nef-deriverte apoptotiske peptider &#39;interaksjon med CXCR4 funnet å indusere en stress respons i disse T-celler som fører til apoptose. Dette bevis tillatt oss å quickly map Nef &#39;s funksjonelle domener; en prosess som ville ha tatt mye lenger ved hjelp av standard DNA-mutagene teknikker som for eksempel alanine skanning mutagenese. Den viste samtidig at disse korte Nef--deriverte peptider beholdt den biologiske funksjon av de apoptotic domenene i den full-lengde protein. Etter å ha identifisert en rolle for extracellular Nef, dvs. apoptose av T-celler, søkte vi en bedre forståelse av hvordan Nef ble secreted fra celler. Ved hjelp av en serie av muterte NEF-konstruerer, vi kartlagt svært konservert Nef protein motivene i de N-terminale regioner av både HIV Nef, og dens Rhesus macaque ekvivalent SIV mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, at er kritiske for exNef sekresjon 13.. En av disse motivene, den Sekresjon Modification Region (SMR; 66VGFPV70), var spesielt kritisk, som alanin utskifting av en hvilken som helst av sine fem aminosyrer enten sterkt redusert eller avskaffet exNef sekresjon. Når den leveres til celler via Active Motif &#39;s Chariot Protein Delivery Reagent, et peptid inneholdende smr festet til en FLAG peptid sekvens (SMRwt) ble funnet å hemme exNef sekresjon fra både Nef-transfekterte og HIV-smittet celler 18.. Basert på vår forrige erfaring med peptider, besluttet vi å bruke denne peptid til å belyse de molekyler og mekanismer ligger til grunn for Nef SMR &#39;s rolle i exNef sekresjon. Ved hjelp den SMRwt peptid som vår &quot;agn protein&quot;, vi co-immunutfelt cellulære bindende partnere av den SMR fra uinfiserte T-celle lysates atten. The FLAG peptid rekkefølgen de er angitt en praktisk håndtak for å fange den SMRwt peptid ved hjelp av anti-FLAG affinitet resin. Vår forrige funn at en enkelt valine til alanin mutasjon i den SMRwt peptid var tilstrekkelig for avskaffe sin hemming av exNef sekresjon identifisert en praktisk, svært spesifikk kontroll peptid (SMRmut) at vi pleide å utelukke co-immunutfelt proteiner ikke spesifikke for den SMR. Ved hjelp av en peptid med den specific domenet av interesse snarere enn den fulle-lengde protein tillatt oss til å omgå den screening av dusinvis av cellulære faktorer som binder seg til andre domener i Nef 19.. Når vi identifisert de SMR-bindende partnere, et logisk neste skritt var å vise at de identifiserte mobilnettet bindende partnere er viktige for det biologiske funksjon 18. Den standard prosedyre for å oppnå dette er å knockdown protein nivåer ved hjelp av mål protein-spesifikk miRNA eller siRNA, og senere assay den effekt på den biologiske funksjon. Vi utførte miRNA knockdown, noe som hindrer translasjon av målet-mRNA, noe som reduserer produksjonen av av målet, med i dette tilfellet en smr-bindende protein. Denne reduksjon av målet protein er en indirekte effekt, og muligens har en tidsforskjøvet utslag for biologiske funksjonen den målrettet proteinet spiller en rolle i. Følgelig, vi også knyttet den mindre vanlige antistoff hemming teknikk for for å fastslå om direkte forstyrre den aktiviteten avmålet protein reduserer eller eliminerer den biologiske funksjon. I denne prosedyren, antistoffer dyrket mot den målrettet proteinet blir transfektert inn i cellen ved hjelp av Chariot Reagent, og samhandle direkte med målet protein enten sequestering den fra sin stedet av funksjon, eller blokkere dens relevant bindende domene. Inhibering av målet protein gjennom denne prosedyre direkte forstyrrer til funksjon, og kan utfylle RNA-knockdown prosedyrer ved å noe bekrefter viktigheten av målet protein til den biologiske funksjon. Mens Chariot Reagent er effektiv på å levere peptider og proteiner inn i celler; denne prosessen er tidkrevende og begrenser hvilke typer eksperimenter, f.eks forlenget eller gjentatt eksponeringer og in vivo dyrestudier som kan utføres. Følgelig, lagt til vi en celle-gjennomtrengende peptid (CPP)-sekvens til SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 til å generere et peptid som kunne bli tatt opp av celler passivtfra de kulturmedier. Denne versjonen var like effektivt som det tidligere ved hemme exNef sekresjon. Beviset fra disse publiserte eksperimentene demonstrerer den evne av små peptider inneholdende spesifikke funksjonelle motiv som kan antagonize funksjonen til den full-lengde protein gjennom kompetitiv hemming, og for å isolere de proteiner som binder til desse motiva. En ville forvente at disse teknikkene bør være nyttig i mange eksperimentelle protokoller. De bør også være effektive seg på engineering romanen peptid hemmere av mange cellulære prosesser; en funksjon som kan bli ytterligere forbedret ved linkage til CPP sekvenser.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Spesifikke korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner; i denne samanheng HIV-1 Nef, ikke bare beholder deres biologiske funksjon, men kan også kompetitivt hemme funksjonen til den full-lengde protein. Et sett med 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyrer i lengde med hver overlappende 10 aminosyrer av nabo dets fordeling, ble brukt til å identifisere motivene i Nef ansvarlig for sin induksjon av apoptose. Peptider inneholdende disse apoptotic motivene indusert apoptose på nivåer sammenlignbare til den full-lengde Nef protein. En andre peptid, avledet fra den Sekresjon Modification Region (SMR) av Nef, beholdt muligheten til å samhandle med cellulære proteiner involvert i Nef &#39;s sekresjon i exosomes (exNef). Dette SMRwt peptid ble brukt som den &quot;agn&quot; protein i co-immunoprecipitation eksperimenter for å isolere cellulære proteiner som binder spesifikt til Nef-&#39;s smr motiv. Protein transfeksjon og antistoff hemming ble brukt til å fysisk forstyrre samspillet betWeen Nef og mortalin, ett av de isolerte SMR-bindende proteiner, og den effekten ble målt med et fluorescent-basert exNef sekresjon-analysen. The SMRwt peptid evne til å utkonkurrere full-lengde Nef for cellulære proteiner som binder den SMR motiv, gjøre det den første hemmer av exNef sekresjon. Således, ved anvendelse av de teknikker som er beskrevet her, som drar nytte de unike egenskapene til spesifikke korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner, kan det hende man akselerere den identifikasjon av funksjonelle motiva i heile proteiner og den utvikling av peptid-baserte hemmere av patogene-funksjoner.

Kartlegging biologisk funksjonelle motiver hjelp Peptider. To regioner ble identifisert på NEF-proteiner som induserer apoptose. Peptid-drevet apoptose ble observert (Figur 2) begynner med peptid N50 (AA30-50), med en topp på N60 (aa40-60) og N70 (aa50-70), og reduseres til bakgrunnsnivået på peptid N100 (aa80-100). Den store Motiv 1 (M1) topp, sentrert om aa50-60, induserer&gt; 80% av de apoptotiske nivåer av full-lengde Nef-protein. En annen, mindre apoptose Toppen ble observert ...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Teknikker for å dissekere mekanismene bak utskillelsen av HIV-1 Nef i exosomes er beskrevet. Spesifikke korte peptider avledet fra Nef protein transfeksjon ble utnyttet for å bestemme strukturen, funksjonen og bindingspartnere av Nef Sekresjon Modification Region. Disse prosedyrene har generell relevans i mange mekanistiske studier.

Peptide-baserte Identifikasjon av Funksjonelle Motifs og deres Binding Partnere

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging av myeloide celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmsvulster ved å spinne Disk Konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling funksjons av en bakteriell Effector fra en ikke-dyrkbar Plant Patogen Ved hjelp av en gjær to-hybrid skjerm

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolering av Peritoneum-avledet mastceller og deres funksjonell karakteristikk med Ca2 +-imaging og omfatter degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikasjon av virulens markører av Mycobacterium abscessus for intracellulær replikering i Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolasjon og identifisering av ekstravaskulær overvåking av immunceller av hjertet

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...